基因擴(kuò)增
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基因擴(kuò)增(gene amplification)
細(xì)胞內(nèi)選擇性復(fù)制DNA, 產(chǎn)生大量的拷貝。如兩棲類卵母細(xì)胞在發(fā)育的早期，rRNA基因的數(shù)量擴(kuò)增到1000多倍?；驍U(kuò)增是通過(guò)形成幾千個(gè)核進(jìn)行的，每個(gè)核里含有幾百拷貝的編碼28S、18S和5.8S的rRNA基因，最后卵母細(xì)胞中的這些rRNA基因的拷貝數(shù)幾乎達(dá)到50萬(wàn)個(gè)，而在相同生物的其它類型細(xì)胞中，這些rRNA基因的拷貝數(shù)只有幾百個(gè)。卵母細(xì)胞中有如此眾多的rRNA基因拷貝，為卵細(xì)胞在受精后的發(fā)育過(guò)程中合成大量核糖體創(chuàng)造了條件。
至于卵母細(xì)胞中rRNA基因擴(kuò)增的機(jī)制，有人認(rèn)為可能是通過(guò)從染色體上分離出來(lái)的環(huán)狀DNA分子，這種環(huán)狀DNA中含有rRNA基因，但是第一個(gè)含有rRNA基因的環(huán)狀DNA是如何形成的尚不清楚。由于環(huán)狀DNA能夠通過(guò)滾環(huán)復(fù)制(rolling circle replication)的方式進(jìn)行復(fù)制，因而能夠產(chǎn)生大量的rRNA基因。
為一特異蛋白質(zhì)編碼的基因的拷貝數(shù)選擇性地增加而其他基因并未按比例增加的過(guò)程。在自然條件下，基因擴(kuò)增是通過(guò)從染色體切除基因的重復(fù)序列再在質(zhì)粒中進(jìn)行染色體外復(fù)制或通過(guò)將核糖體RNA的全部重復(fù)序列生成RNA轉(zhuǎn)錄物再轉(zhuǎn)錄生成原來(lái)DNA分子的額外拷貝而實(shí)現(xiàn)的。在實(shí)驗(yàn)室已建立了不等交換、從裂解細(xì)胞提取DNA或經(jīng)過(guò)滾環(huán)復(fù)制（rolling circle replication）生成染色體外序列進(jìn)行人工基因擴(kuò)增。例如，在非洲爪蟾的卵母細(xì)胞中原有rRNA基因（rDNA）約200個(gè)拷貝，在減數(shù)分裂Ⅰ的粗線期，這個(gè)基因開(kāi)始迅速?gòu)?fù)制，到雙線期它的拷貝數(shù)約為200萬(wàn)個(gè)，擴(kuò)增近4000倍，可用于合成10的12次方個(gè)核糖體，以滿足卵裂期和胚胎期合成大量蛋白質(zhì)的需要。在果蠅中也發(fā)現(xiàn)了基因擴(kuò)增現(xiàn)象。 在卵巢成熟之前，卵巢顆粒細(xì)胞中產(chǎn)生卵殼蛋白的基因被擴(kuò)增。果蠅中的卵原細(xì)胞，經(jīng)4次分裂產(chǎn)生16個(gè)細(xì)胞，其中一個(gè)是卵母細(xì)胞（oocyte），將發(fā)育成為卵細(xì)胞，其他15個(gè)是營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞（nurse cell），它們?yōu)槁鸭?xì)胞的形成提供大量的蛋白質(zhì)及其他大分子物質(zhì)，營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞之所以能夠產(chǎn)生大量的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，是因?yàn)樗鼈冊(cè)谛纬傻倪^(guò)程中發(fā)生了多次特殊的DNA復(fù)制，卵殼蛋白等基因拷貝數(shù)顯著增加。
PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶鏈反應(yīng))是一種選擇性體外擴(kuò)增DNA或RNA的方法.它包括三個(gè)基本步驟: (1) 變性(Denature):目的雙鏈DNA片段在94℃下解鏈; (2) 退火(Anneal):兩種寡核苷酸引物在適當(dāng)溫度(50℃左右)下與模板上的目的序列通過(guò)氫鍵配對(duì);(3) 延伸(Extension):在Taq DNA聚合酶合成DNA的最適溫度下,以目的DNA為模板進(jìn)行合成.由這三個(gè)基本步驟組成一輪循環(huán),理論上每一輪循環(huán)將使目的DNA擴(kuò)增一倍（圖4）,這些經(jīng)合成產(chǎn)生的DNA又可作為下一輪循環(huán)的模板,所以經(jīng)25-35輪循環(huán)就可使DNA擴(kuò)增達(dá)106 倍。
PCR：聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction ,PCR)是80年代中期發(fā)展起來(lái)的體外核酸擴(kuò)增技術(shù)。它具有特異、敏感、產(chǎn)率高、快速、簡(jiǎn)便、重復(fù)性好、易自動(dòng)化等突出優(yōu)點(diǎn)；能在一個(gè)試管內(nèi)將所要研究 的目的基因或某一DNA片段于數(shù)小時(shí)內(nèi)擴(kuò)增至十萬(wàn)乃至百萬(wàn)倍,使肉眼能直接觀察和判斷；可從一根毛發(fā)、一滴血、甚至一個(gè)細(xì)胞中擴(kuò)增出足量的DNA供分析研 究和檢測(cè)鑒定。過(guò)去幾天幾星期才能做到的事情，用 PCR幾小時(shí)便可完成。PCR技術(shù)是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的一項(xiàng)革命性創(chuàng)舉和里程碑。
PCR是在體外由酶促合成特異DNA片段的一種新方法。在反應(yīng)液中含有模板DNA、人工合成的目的片段的5′端和3′端PCR引物、合成DNA的四種脫氧核苷酸底物（dNTP）、一種耐熱的DNA聚合酶（Taq酶），以及含各種離子的緩沖液。此反應(yīng)體系由高溫變性、低溫復(fù)性及適溫延伸等步驟共同組成一個(gè)周期，然后反復(fù)循環(huán)進(jìn)行，使目的DNA片段得以迅速擴(kuò)增。其主要步驟是，待擴(kuò)增的模板DNA在94℃高溫下解鏈成為單鏈DNA；低溫復(fù)性時(shí)人工合成的兩個(gè)寡聚核苷酸引物分別與目的片段兩條鏈的兩端互補(bǔ)結(jié)合；在72℃時(shí)Taq酶可將dNTP從引物3′端開(kāi)始摻入，沿模板DNA5′→3′方向延伸，合成一條新的互補(bǔ)鏈。由于每一周期所產(chǎn)生的新DNA鏈均能成為下一循環(huán)的模板，所以PCR產(chǎn)物以指數(shù)方式增加，經(jīng)過(guò)25~30個(gè)周期后，一般可擴(kuò)增至106~107。PCR技術(shù)由于有操作簡(jiǎn)便、省時(shí)間、特異性及敏感性均較高等特點(diǎn)，所以一經(jīng)問(wèn)世，就得到了廣泛的應(yīng)用，許多條件較差的實(shí)驗(yàn)室，也得以開(kāi)展分子生物學(xué)研究，故可看作是分子生物學(xué)技術(shù)的一次革命。在PCR反應(yīng)的各種成分中，模板DNA和引物是兩個(gè)重要因素，雖然PCR敏感性很高，可以檢測(cè)微量DNA的用量，以不低于0.1μg為宜。模板DNA的純度要求不是很嚴(yán)格，但不能混有任何蛋白酶、核酸酶及Taq酶抑制劑。引物是決定PCR結(jié)果的關(guān)鍵，引物長(zhǎng)度以15~30個(gè)堿基為宜；（G+C）約占總堿基中的50%；兩個(gè)引物之間不應(yīng)發(fā)生互補(bǔ)；應(yīng)盡量減少重復(fù)的堿基，特別是在3′端。PCR可用于擴(kuò)增DNA或RNA。在擴(kuò)增RNA時(shí)必須先用反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA第一鏈，然后進(jìn)行PCT擴(kuò)增，這種方法稱為逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）。目前PCR技術(shù)在腫瘤研究中也得到廣泛的應(yīng)用。例如從腫瘤細(xì)胞提取基因組DNA然后用設(shè)計(jì)好的對(duì)某個(gè)基因特異的OCR引物，如p53基因第5~8外顯子的引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后用單鏈DNA構(gòu)型多態(tài)性（SSCP）分析技術(shù)或直接DNA測(cè)序技術(shù)，研究p53基因的點(diǎn)突變。RT-PCR技術(shù)廣泛應(yīng)用于檢測(cè)某個(gè)癌基因、抑癌基因或其他腫瘤相關(guān)基因的過(guò)度表達(dá)或低表達(dá)。
PCR技術(shù)基本原理
PCR技術(shù)的基本原理 類似于DNA的 天然復(fù)制過(guò)程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。PCR由變性--退火--延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加 熱至93℃左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；②模板DNA與引 物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；③引物的延伸：DNA模板--引物結(jié)合 物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈重復(fù)循環(huán)變性--退火--延伸三過(guò)程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需 2～4分鐘，2～3小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬(wàn)倍。到達(dá)平臺(tái)期(Plateau)所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝。
PCR技術(shù)簡(jiǎn)史
PCR的最早設(shè)想 核酸研究已有100多年的歷史，本世紀(jì)60年代末、70年代初人們致力于研究基因的體外分離技術(shù)，Korana于1971年最早提出核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想：“經(jīng)過(guò)DNA變性，與合適的引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復(fù)該過(guò)程便可克隆tRNA基因”。
PCR的實(shí)現(xiàn)
1985年國(guó)PE-Cetus公司人類遺傳研究室的Mullis等發(fā)明了具有劃時(shí)代意義的聚合酶鏈反應(yīng)。其原理類似于DNA的體內(nèi)復(fù)制，只是在試管中給 DNA的體外合成提供以致一種合適的條件---摸板DNA，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，合適的緩沖體系，DNA變性、復(fù)性及延伸的溫度與時(shí)間。
PCR的改進(jìn)與完善 Mullis最初使用的DNA聚合酶是大腸桿菌DNA聚合酶I的 Klenow片段，其缺點(diǎn)是：①Klenow酶不耐高溫，90℃會(huì)變性失活，每次循環(huán)都要重新加。②引物鏈延伸反應(yīng)在37℃下進(jìn)行，容易發(fā)生模板和引物之 間的堿基錯(cuò)配，其PCR產(chǎn)物特異性較差，合成的DNA片段不均一。此種以Klenow酶催化的PCR技術(shù)雖較傳統(tǒng)的基因擴(kuò)增具備許多突出的優(yōu)點(diǎn)，但由于 Klenow酶不耐熱，在DNA模板進(jìn)行熱變性時(shí)，會(huì)導(dǎo)致此酶鈍化，每加入一次酶只能完成一個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)周期，給PCR技術(shù)操作程序添了不少困難。這使得 PCR技術(shù)在一段時(shí)間內(nèi)沒(méi)能引起生物醫(yī)學(xué)界的足夠重視。1988年初，Keohanog改用T4 DNA聚合酶進(jìn)行PCR，其擴(kuò)增的DNA片段很均一，真實(shí)性也較高，只有所期望的一種DNA片段。但每循環(huán)一次，仍需加入新酶。1988年Saiki 等從溫泉中分離的一株水生嗜熱桿菌(thermus aquaticus) 中提取到一種耐熱DNA聚合酶。此酶具有以下特點(diǎn)：①耐高溫，在70℃下反應(yīng)2h后其殘留活性大于原來(lái)的90%，在93℃下反應(yīng)2h后其殘留活性是原來(lái)的 60%，在95℃下反應(yīng)2h后其殘留活性是原來(lái)的40%。②在熱變性時(shí)不會(huì)被鈍化，不必在每次擴(kuò)增反應(yīng)后再加新酶。③大大提高了擴(kuò)增片段特異性和擴(kuò)增效 率，增加了擴(kuò)增長(zhǎng)度(2.0Kb)。由于提高了擴(kuò)增的特異性和效率，因而其靈敏性也大大提高。為與大腸桿菌多聚酶I Klenow片段區(qū)別，將此酶命名為Taq DNA多聚酶(Taq DNA Polymerase)。此酶的發(fā)現(xiàn)使PCR廣泛的被應(yīng)用。
PCR的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)
PCR的三個(gè)反應(yīng)步驟反復(fù)進(jìn)行，使DNA擴(kuò)增量呈指數(shù)上升。反應(yīng)最終的DNA 擴(kuò)增量可用Y＝(1＋X)n計(jì)算。Y代表DNA片段擴(kuò)增后的拷貝數(shù)，X表示平(Y)均每次的擴(kuò)增效率，n代表循環(huán)次數(shù)。平均擴(kuò)增效率的理論值為100%， 但在實(shí)際反應(yīng)中平均效率達(dá)不到理論值。反應(yīng)初期，靶序列DNA片段的增加呈指數(shù)形式，隨著PCR產(chǎn)物的逐漸積累，被擴(kuò)增的DNA片段不再呈指數(shù)增加，而進(jìn) 入線性增長(zhǎng)期或靜止期，即出現(xiàn)“停滯效應(yīng)”，這種效應(yīng)稱平臺(tái)期數(shù)、PCR擴(kuò)增效率及DNA聚合酶PCR的種類和活性及非特異性產(chǎn)物的競(jìng)爭(zhēng)等因素。大多數(shù)情 況下，平臺(tái)期的到來(lái)是不可避免的。
PCR擴(kuò)增產(chǎn)物
可分為長(zhǎng)產(chǎn)物片段和短產(chǎn)物片段兩部分。短產(chǎn)物片段的長(zhǎng)度嚴(yán)格地限定在兩個(gè)引物鏈5’端之間，是需要擴(kuò)增的特定片段。短產(chǎn)物片段和長(zhǎng)產(chǎn)物片段是由于引物所 結(jié)合的模板不一樣而形成的，以一個(gè)原始模板為例，在第一個(gè)反應(yīng)周期中，以兩條互補(bǔ)的DNA為模板，引物是從3’端開(kāi)始延伸，其5’端是固定的，3’端則沒(méi) 有固定的止點(diǎn)，長(zhǎng)短不一，這就是“長(zhǎng)產(chǎn)物片段”。進(jìn)入第二周期后，引物除與原始模板結(jié)合外，還要同新合成的鏈(即“長(zhǎng)產(chǎn)物片段”)結(jié)合。引物在與新鏈結(jié)合 時(shí)，由于新鏈模板的5’端序列是固定的，這就等于這次延伸的片段3’端被固定了止點(diǎn)，保證了新片段的起點(diǎn)和止點(diǎn)都限定于引物擴(kuò)增序列以內(nèi)、形成長(zhǎng)短一致的 “短產(chǎn)物片段”。不難看出“短產(chǎn)物片段”是按指數(shù)倍數(shù)增加，而“長(zhǎng)產(chǎn)物片段”則以算術(shù)倍數(shù)增加，幾乎可以忽略不計(jì)， 這使得PCR的反應(yīng)產(chǎn)物不需要再純化，就能保證足夠純DNA片段供分析與檢測(cè)用。
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