醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)/基因轉(zhuǎn)移方法
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（1）特異正常基因的分離與克?。簯?yīng)用重組DNA和分子克隆技術(shù)結(jié)合基因定位研究成果，已有不少基因并將會(huì)有更多人類基因被分離和克隆，這是基因治療的前提，在當(dāng)代分子生物技術(shù)條件下，一般來說，只要有基因探針和準(zhǔn)確的基因定位，任何基因都可被克隆。除此，現(xiàn)在既可人工合成DNA探針，還可用DNA合成儀在體外人工合成基因，這些都是在基因治療前，分離克隆特異基因的有利條件。
（2）外源基因的轉(zhuǎn)移：基因轉(zhuǎn)移（gene transfer）是將外源基因?qū)爰?xì)胞內(nèi)，其轉(zhuǎn)移方法較多，常用的要有下列幾類：
1）化學(xué)法：將正?；駾NA（及其拷貝）與帶電荷物質(zhì)和磷酸鈣、DEAE－葡萄糖或與若干脂類混合，形成沉淀的DNA微細(xì)顆粒，直接傾入培養(yǎng)基中與細(xì)胞接觸，由于鈣離子有促進(jìn)DNA透過細(xì)胞有作用，某些化合物可擾亂細(xì)胞膜，故可將DNA輸入細(xì)胞內(nèi)，并整合于受體細(xì)胞的基因組中，在適當(dāng)?shù)臈l件下，整合基因得以表達(dá)，細(xì)胞亦可傳代。這種方法簡(jiǎn)單，但效率極低，一般1000－100000個(gè)細(xì)胞中只有一個(gè)細(xì)胞可結(jié)合導(dǎo)入的外源基因。要達(dá)到治療目的，就需要從病人獲得大量所需的受體細(xì)胞。當(dāng)然，可以通過選擇培養(yǎng)的方法來提高轉(zhuǎn)化率。
①電穿孔法：電穿孔法（electroporotion）是將細(xì)胞置于高壓脈沖電場(chǎng)中，通過電擊使細(xì)胞產(chǎn)生可逆性的穿孔，周圍基質(zhì)中的DNA可滲進(jìn)細(xì)胞，但有時(shí)也會(huì)使細(xì)胞受到嚴(yán)重?fù)p傷。
②顯微注射法：顯微注射（microinjection）是在顯微鏡直視下，向細(xì)胞核內(nèi)直接注射外源基因，這種方法應(yīng)是有效的。但一次只能注射一個(gè)細(xì)胞，工作耗力費(fèi)時(shí)。此法用于生殖細(xì)胞時(shí)，有效率可達(dá)10％。直接用于體細(xì)胞卻很困難。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)用這種方法將目的基因注入生殖細(xì)胞，使之表達(dá)而傳代，這樣的動(dòng)物就稱為轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，目前成功使用得較多的是轉(zhuǎn)基因小鼠（transgenic mice），它可作為繁殖大量后代的疾病動(dòng)物模型。
③脂質(zhì)體法：脂質(zhì)體（liposome）法是應(yīng)用人工脂質(zhì)體包裝外源基因，再與靶細(xì)胞融合，或直接注入病灶組織，使之表達(dá)。
3）同源重組法：同源重組（homologous recombination）是將外源基因定位導(dǎo)入受體細(xì)胞的染色體上，在該座位因有同源序列，通過單一或雙交換，新基因片段替換有缺陷的片段，達(dá)到修正缺陷基因的目的。如在新基因片段旁組裝一Neo基因，則在同源重組后，因有Neo基因，可在含有新霉素（neomycin）的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，從而使未插入新基因片段的細(xì)胞死亡。對(duì)于體細(xì)胞基因治療，體外培養(yǎng)細(xì)胞的時(shí)間不能過長(zhǎng)，篩選量大，故在臨床上應(yīng)用也受限制難以進(jìn)行。今后如能改進(jìn)技術(shù)，提高重組率，這種定點(diǎn)修正基因的方法仍是有前景的。
4）病毒介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移：前述的化學(xué)和物理方法都是通過傳染方式基因轉(zhuǎn)移。病毒介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移（viral mediatedgene transfer）是通過轉(zhuǎn)換方式完成基因轉(zhuǎn)移，即以病毒為載體（vector）,將外源目的基因通過基因重組技術(shù)，將其組裝于病毒上，讓這種重組病毒去感染受體宿主細(xì)胞，這種病毒稱為病毒運(yùn)載體（viral vector）。目前應(yīng)用的有兩種病毒介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移方法。
①反轉(zhuǎn)錄病毒載體：反轉(zhuǎn)錄病毒雖是RNA病毒，但有反轉(zhuǎn)錄酶，可使RNA轉(zhuǎn)錄為DNA，再整合到宿主細(xì)胞基因組。反轉(zhuǎn)錄病毒載體有以下的優(yōu)點(diǎn)首先是具有穿透細(xì)胞的能力，可使近100％的受體細(xì)胞被感染，轉(zhuǎn)化細(xì)胞效率高；其次，它能感染廣譜動(dòng)物物種和細(xì)胞類型而無嚴(yán)格的組織特異性；再者隨機(jī)整俁的病毒可長(zhǎng)期存留，一般無害于細(xì)胞，但也存在缺點(diǎn)：這種載體只能把其DNA整合到能旺盛分裂細(xì)胞的染色體，而不適合于那些不能正常分裂的細(xì)胞，如神經(jīng)元。最嚴(yán)重的問題是由于病毒自身含有病毒蛋白及癌基因，就有使宿主細(xì)胞感染病毒和致癌的危險(xiǎn)性。因此，人們有目的地將病毒基因及其癌基因除去，僅留它們的外殼蛋白，以保留其穿透細(xì)胞的功能，試圖避免上述缺點(diǎn)。這種改造后的病毒稱為缺陷型病毒（defective virus）。這樣的病毒中的反轉(zhuǎn)錄酶可將RNA轉(zhuǎn)化為DNA，有助于該DNA順利進(jìn)入宿主細(xì)胞的基因組，而該病毒則死亡。由于病毒整合基因組是隨機(jī)的，所以還是可能激活細(xì)胞的原癌基因，以及因隨機(jī)插入發(fā)生插入突變。
在反轉(zhuǎn)錄病毒載體中，最常用于人類的是莫洛尼（Mooney）鼠白血病病毒（murine leukemia virus;Mo-MLV），其人工構(gòu)建的結(jié)構(gòu)如圖14-1。
②DNA病毒介導(dǎo)載體（DNA viral mekiated vector）：DNA病毒包括腺病毒、SV40、牛乳頭瘤病毒、皰疹病毒等，一般認(rèn)為這類病毒難于改造成缺陷型病毒，實(shí)用意義不大，但
圖14-1 Mo-MLV結(jié)構(gòu)示意圖
LTR：長(zhǎng)末端重復(fù)序列，內(nèi)含啟動(dòng)子、增強(qiáng)子及有關(guān)調(diào)節(jié)順序；gag：病毒核心抗原基因；
env：病毒外殼蛋白基因；pol：反轉(zhuǎn)錄酶基因
牛乳頭瘤病毒重組后，可不插入宿主染色體中引起插入突變，又可在宿主染色體外獨(dú)立復(fù)制，并表達(dá)出基因產(chǎn)物。有人發(fā)現(xiàn)，因缺少E1區(qū)而致復(fù)制缺陷的腺病毒，可在表達(dá)E1基因的細(xì)胞中繁殖。后來證明，載有外源DNA的復(fù)制缺陷腺病毒呈現(xiàn)相同繁殖的特點(diǎn)。1993年法等國(guó)成功采用腺病毒載體進(jìn)行心、腦、肺、肝內(nèi)膽管和肌肉組織的體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移。它代表了基因治療的新方向。圖14-2是人的外源基因包裝在缺陷型反轉(zhuǎn)錄病毒中，感染細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)后再輸入病人進(jìn)行治療的模式圖。
圖14-2 人的外源基因包裝在缺陷型反轉(zhuǎn)錄病毒中感染細(xì)胞
經(jīng)培養(yǎng)后再輸入病人體內(nèi)進(jìn)行治療模式圖
最近，美國(guó)設(shè)計(jì)了一個(gè)的腺病癥載體（圖14-3），它是用一個(gè)化學(xué)連接器即賴氨酸鏈（lysine chain）將DNA栓在病毒外殼上，這樣組成的運(yùn)輸器，通過一個(gè)表面抗體而進(jìn)入細(xì)胞核，使宿主基因與治療基因共同表達(dá)。這個(gè)新病毒載體稱為腺病毒多賴氨酸DNA復(fù)合體（adeno virus-polylysine DNA-complex）。
圖14-3 腺病毒賴氨酸DNA復(fù)合體
采用復(fù)制缺陷的腺病毒進(jìn)行基因治療有以下優(yōu)點(diǎn)：①該病毒可感染分裂和非分裂的細(xì)胞，并能得到大量基因產(chǎn)物，對(duì)神經(jīng)細(xì)胞、心肌細(xì)胞等基因缺陷的糾正有特殊意義；②病毒顆粒相對(duì)穩(wěn)定，并易于純化和濃縮，且感染力不降低；③可有效轉(zhuǎn)導(dǎo)多種靶細(xì)胞后而少游離于細(xì)胞基因組外，并持續(xù)表達(dá)；④已用于基因治療的Ad5屬腺病毒C亞群，無致癌性。前述的新腺病毒載體還有一大優(yōu)點(diǎn)是可以成功地運(yùn)載48000bp的基因，而其它病毒只能運(yùn)輸70 00bp的基因。這些優(yōu)點(diǎn)顯示了腺病毒介導(dǎo)載體的廣闊應(yīng)用前景。
 基因治療的方法 | 靶細(xì)胞  |
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