臨床生物化學(xué)/基因工程的常用工具

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臨床生物化學(xué)

診斷分子生物學(xué)基本技術(shù)
- 分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)
  - 基因工程的常用工具
  - 目的基因
  - 基因庫的建立
  - 核酸的分離與純化
  - 探針制備

（一）載體

載體（Vector）是把外源DNA（目的基因）導(dǎo)入宿主細(xì)胞，使之傳代、擴(kuò)增、表達(dá)的工具。載體有質(zhì)粒（plasmid）、噬菌體、單鏈絲狀噬菌體和粘性末端質(zhì)粒（粘粒）、病毒等。載體具有能自我復(fù)制；有可選擇的，便于篩選、鑒定的遺傳標(biāo)記；有供外源DNA插入的位點(diǎn)；本身體積小等特征。

質(zhì)粒存在于多種細(xì)菌，是染色體（核）以外的獨(dú)立遺傳因子，由雙鏈環(huán)狀DNA組成，幾乎完全裸露，很少有蛋白質(zhì)結(jié)合。質(zhì)粒有嚴(yán)緊型和松弛型之分。嚴(yán)緊型由DNA多聚酶Ⅲ復(fù)制，一個(gè)細(xì)胞可復(fù)制1-5個(gè)質(zhì)粒。而松弛型由DNA多聚酶Ⅰ復(fù)制，一個(gè)細(xì)胞可復(fù)制30-50個(gè)質(zhì)粒，如果用氯霉素可阻止蛋白質(zhì)合成，使質(zhì)粒有效利用原料，復(fù)制更多的質(zhì)粒。質(zhì)粒經(jīng)過改造品種繁多，常用的有pBR322、pUC系列等。這些質(zhì)粒都含有多個(gè)基本基因，如復(fù)制起動(dòng)區(qū)（復(fù)制原點(diǎn)Ori），便于復(fù)制擴(kuò)增；抗抗生素標(biāo)記（抗氨芐青霉素Ap^r、抗四環(huán)素Tc^r等）或大腸埃希菌部分乳糖操縱子（E.coli LacZ）等，便于基因重組體的篩選；基因發(fā)動(dòng)子（乳糖操縱子Lac、色氨酸操縱子Trp等）和轉(zhuǎn)錄終止序列，便于插入的外源基因轉(zhuǎn)錄、翻譯表達(dá)。質(zhì)粒上還有許多限制性內(nèi)切酶的切點(diǎn)，即基因插入位點(diǎn)，又叫基因重組位點(diǎn)，基因克隆位點(diǎn)。

常用噬菌體載體有單鏈?zhǔn)删wM13系統(tǒng)；雙鏈?zhǔn)删w系統(tǒng)。噬菌體應(yīng)和相應(yīng)的宿主細(xì)胞配合使用。以上載體各有特點(diǎn)，便于選擇，靈活應(yīng)用。

（二）工具酶

工具酶是基因重組技術(shù)不可缺少的工具。主要有限制性內(nèi)切酶、連接酶、核酸聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、核酸酶等。

限制性內(nèi)切酶有Ⅰ型和Ⅱ型限制性DNA內(nèi)切酶之分，Ⅱ型能嚴(yán)格識(shí)別核酸序列，并在識(shí)別區(qū)內(nèi)特定的核苷酸處切開DNA雙鏈。故通常所指都是Ⅱ型限制性DNA內(nèi)切酶。識(shí)別分核苷酸和六核苷酸，其序列旋轉(zhuǎn)對(duì)稱。切口分開端和粘端，產(chǎn)生3′－OH和5′－P末端。內(nèi)切酶品種多，使用時(shí)應(yīng)注意溫度、緩沖液用量（一般1μg DNA/2-5單位酶）等反應(yīng)條件。

酶	識(shí)別序列	切口
Alu Ⅰ	…AGCT…	…AG CT…	四核苷酸
	…TCGA…	…TC GA…	平端切口
Eco R1	…GAATTC…	…G AATTC…	六核苷酸
	…CTTAAG…	…CTTAA G…	粘端切口

連接酶有T4噬菌體DNA連接酶、T4噬菌體RNA連接酶、大腸埃希菌DNA連接酶等。DNA連接酶可連接平端，也連接粘端。反應(yīng)需有Mg²⁺和ATP存在，pH7.5-7.6。最適溫度37℃，30℃以下活性明顯下降，但考慮到被連接DNa 的穩(wěn)定性和粘性末端的退火溫度，一般平端連接用20-25℃，粘端連接用12℃左右。

聚合酶有DNA聚合酶（以DNA為模板合成DNA大腸埃希菌DNA聚合酶Ⅰ，大腸埃希菌DNA聚合酶Ⅰ大片段（Klenow大片段），T4或T7噬菌體DNA聚合酶等）；RNA聚合酶（以DNA為模板合成RNA，T7或T3噬菌體RNA聚合酶）；逆轉(zhuǎn)錄酶（以RNA為模板合成DNA，除RNA病毒中發(fā)現(xiàn)外，發(fā)現(xiàn)大腸埃希菌DNA聚合酶Ⅰ和Taq DNA聚合酶都有逆轉(zhuǎn)錄活性）。

大腸埃希菌DNA聚合酶Ⅰ具有5′→3′聚合酶活性和5′→3′，3′→5′外切酶活性。Klenow片段是DNA聚合酶Ⅰ被枯草桿菌酶作用產(chǎn)生的一個(gè)大片段，有5′→3′聚合酶和5′→3′外切酶活性，無3′→5′外切酶活性?？捎糜谌笨诜g（Nick translation）法標(biāo)記核酸，也可用于DNA序列測(cè)定，修補(bǔ)DNA鏈等。

核酸酶有DNase、RNase、核酸酶S1等，可水解相應(yīng)的DNA和RNA，核酸酶S1可降解單鏈DNA和RNA，用量增大也可降解雙鏈核酸。它可用于切去ds-cDNA合成中產(chǎn)生的發(fā)夾環(huán)。

末端轉(zhuǎn)移酶在Mg²⁺存在下，選擇3′－OH端單鏈DNA為引物加成核苷酸，在Co²⁺存在下，選擇3′－OH端雙鏈DNA為引物加成核苷酸，形成多聚核苷酸尾。常用于核酸末端標(biāo)記和核酸連接的互補(bǔ)多聚尾（連接器）。

堿性磷酸酶去除5′－P，可防止二分子DNA片段5′端P基團(tuán)自身空間障礙，影響DNA分子之間的連接，一般用堿性磷酸酶處理載體DNA除去5′端P基團(tuán)，在連接酶作用下目的基因的5′端P先與載體3′端OH連接，再通過復(fù)制修復(fù)另一條鏈，使二條鏈完全連接。該方法大大提高了連接效率（圖18-1）。

經(jīng)堿性磷酸酶處理后載體DNA與目的基因DNA的連接