基因診斷與性病/PCR方法

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基因診斷與性傳播疾病

基因診斷與性傳播疾病
- 基因擴增技術(shù)（PCR）

基因診斷與性傳播疾病目錄

（一）試劑

（1）引物：決定擴增的特異性。根據(jù)檢測的DNA不同，選用不同引物，每種病原微生

物都有自己特異的引物。

（2）耐熱的DNA聚合酶：此酶是從耐熱細菌中分離出來的，能耐受高溫90℃-100℃。

（3）10×PCR緩沖液：500mmol/l KCl;100mmol/LTris-HCl(pH8.4,20℃)150mmol/L MgCl2,1mg/ml明膠。10×PCR緩沖液隨酶一起購買。

（4）5mmol/L dNTP貯備液：將dATP、dCTP、dGTP和dTTP鈉鹽各100mg合并，加入滅菌去離子水溶解，用NaOH調(diào)pH至中性，分裝每份300μl，-20℃保存。dNTP濃度最好用UV吸收法精確測定?，F(xiàn)用dNTP溶液均有商品化產(chǎn)品。

（5）DNA模板：用處理液將待測標本處理，不同處理方法、操作各異，但目的是暴露標本中被檢測的DNA。

（二）操作程序

過去標準的PCR操作程序是將PCR必需反應(yīng)成份分別加入一微量離心管中，然后置于一定的循環(huán)參數(shù)條件下進行循環(huán)擴增。具體如下：

（1）向一微量離心管中依次加入

DNA模板 10²-10⁵拷貝

引物　各1μmol/L

dNTP　　各200μmol/L

10×PCR緩沖液1/10體積

ddH₂O　補到終體積（終體積50μl-100μl）

混勻后，離心15s使反應(yīng)成分集于管底。以上步驟僅在實驗研究用，現(xiàn)在商品化試劑已將dNTP、10×PCR緩沖液，引物，ddH2O混合在一起，反應(yīng)體積為20-25μl，只要試驗人員加入處理好的樣品就可以了。

（2）加石蠟油50-100μl于反應(yīng)液表面以防蒸發(fā)。置反應(yīng)管于97℃變性10min。

（3）冷至延伸溫度時，加入1-5u Taq DNA聚合酶，離心30s使酶和反應(yīng)液充分混合?，F(xiàn)在臨床使用試劑酶通常已加入反應(yīng)液中。

（4）PCR的循環(huán)程序為：94℃變性30s，55℃退火20s，然后在72℃延伸30s，共循環(huán)30-35次。最后一次循環(huán)結(jié)束后，再將反應(yīng)管置72℃溫育5min，以確保充分延伸。

PCR尚可用于組織標本DNA的擴增。由于固定組織標本的DNA常發(fā)生降解，就給常用的分析方法如Southern轉(zhuǎn)印雜交等帶來一定困難。87年Impraim等人首先將PCR技術(shù)引入固定包埋組織內(nèi)DNA分析。他們先從組織標本中提取DNA，再用PCR進行特異性的DNA擴增，應(yīng)用這種方法，他們成功地從保存30至40年久的組織標本DNA中擴增了HPV病毒基因片段。但這種方法需要提取DNA，操作比較繁瑣。1988年Shibata等人對Impraim的方法進行了改進。他們將固定包埋的組織塊制成5-10um厚，0.4cm大小的切片。將切片放入容積為500μl的Eppendorf管內(nèi)。加入400μl二甲苯脫脂，離心除去二甲苯，用400μl 95%乙醇洗去殘余二甲苯。離心除盡乙醇、加入100μlPCR反應(yīng)基質(zhì)，將Eppendorf管放入沸水浴中煮10min，然后按前述PCR方法進行DNA擴增。

在應(yīng)用PCR方法檢測RNA 病毒時，首先應(yīng)將RNA轉(zhuǎn)化成cDNA才能進行擴增，因為PCR只能對DNA模板進行擴增，我們把這種RNA的PCR反應(yīng)稱為反轉(zhuǎn)錄PCR，簡稱RT-PCR。把由RNA轉(zhuǎn)化成DNA的過程叫做反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄需要在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下完成。