誘變
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誘變是指用物理、化學(xué)因素誘導(dǎo)植物的遺傳特性發(fā)生變異的方法，通常用于選育菌種、得到高產(chǎn)量植物種子等。
誘變操作其實(shí)很簡(jiǎn)單，即用誘變劑直接或間接地處理生殖細(xì)胞。對(duì)細(xì)菌等生物而言，沒(méi)有體細(xì)胞與生殖細(xì)胞的區(qū)別，處理起來(lái)就更容易了。
誘變劑大致可分為四類。
一．物理誘變
物理誘變劑主要有紫外線，X—射線，γ-射線，快中子，激光，微波，離子束等。
1紫外線
我們知道，DNA和RNA的嘌呤和嘧啶有很強(qiáng)的紫外光吸收能力,最大的吸收峰在260nm，因此波長(zhǎng)260nm的紫外輻射是最有效的誘變劑.對(duì)于紫外線的作用已有多種解釋,但研究的比較清楚的一個(gè)作用是使DNA分子形成嘧啶二聚體,即兩個(gè)相鄰的嘧啶共價(jià)連接，二聚體出現(xiàn)會(huì)減弱雙鍵間氫鍵的作用,并引起雙鏈結(jié)構(gòu)扭曲變形,阻礙堿基間的正常配對(duì),從而有可能引起突變或死亡.另外二聚體的形成,會(huì)妨礙雙鏈的解開(kāi),因而影響DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄.總之紫外輻射可以引起堿基轉(zhuǎn)換、顛換、移碼突變或缺失等［1］。
2γ-射線
γ-射線屬于電離輻射,是電磁波.一般具有很高的能量,能產(chǎn)生電離作用,因而能直接或間接地改變DNA結(jié)構(gòu).其直接效應(yīng)是,脫氧核糖的堿基發(fā)生氧化,或脫氧核糖的化學(xué)鍵和糖-磷酸相連接的化學(xué)鍵斷裂,使得DNA的單鏈或雙鏈鍵斷裂.其間接效應(yīng)是電離輻射使水或有機(jī)分子產(chǎn)生自由基,這些自由基與細(xì)胞中的溶質(zhì)分子起作用,發(fā)生化學(xué)變化,作用于DNA分子而引起缺失和損傷.此外,電離輻射還能引起染色體畸變,發(fā)生染色體斷裂,形成染色體結(jié)構(gòu)的缺失、易位和倒位等［2］.
3激光
激光在微生物誘變育種方面的研究與開(kāi)發(fā)應(yīng)用比較晚。激光誘變育種技術(shù)研究始于20世紀(jì)60年代,經(jīng)過(guò)世界各國(guó)40多年的開(kāi)發(fā)應(yīng)用研究,不僅證明激光和普通光在本質(zhì)上都是電磁波,它們發(fā)光的微觀機(jī)制都與組成發(fā)光物質(zhì)的原子、分子能量狀態(tài)和變化密切相關(guān)。激光是一種與自然光不同的輻射光,它具有能量高度集中、顏色單一、方向性好、定向性強(qiáng)等特性。激光通過(guò)光效應(yīng)、熱效應(yīng)和電磁效應(yīng)的綜合作用,能使生物的染色體斷裂或形成片斷,甚至易位和基因重組［3］。
4微波
微波輻射屬于一種低能電磁輻射,具有較強(qiáng)生物效應(yīng)的頻率范圍在300MHz~300GHz,對(duì)生物體具有熱效應(yīng)和非熱效應(yīng)。其熱效應(yīng)是指它能引起生物體局部溫度上升,從而引起生理生化反應(yīng);非熱效應(yīng)指在微波作用下,生物體會(huì)產(chǎn)生非溫度關(guān)聯(lián)的各種生理生化反應(yīng)。在這兩種效應(yīng)的綜合作用下,生物體會(huì)產(chǎn)生一系列突變效應(yīng)。因而,微波也被用于多個(gè)領(lǐng)域的誘變育種,如農(nóng)作物育種、禽獸育種和工業(yè)微生物育種,并取得了一定成果［4］。
5離子束
離子注入是20世紀(jì)80年代初興起的一項(xiàng)高新技術(shù),主要用于金屬材料表面的改性。1986年以來(lái)逐漸用于農(nóng)作物育種,近年來(lái)在微生物育種中逐漸引入該技術(shù)。離子注入誘變是利用離子注入設(shè)備產(chǎn)生高能離子束(40~60keV)并注入生物體引起遺傳物質(zhì)的永久改變,然后從變異菌株中選育優(yōu)良菌株的方法。離子束對(duì)生物體有能量沉積(即注入的離子與生物體大分子發(fā)生一系列碰撞并逐步失去能量,而生物大分子逐步獲得能量進(jìn)而發(fā)生鍵斷裂、原子被擊出位、生物大分子留下斷鍵或缺陷的過(guò)程)和質(zhì)量沉積(即注入的離子與生物大分子形成新的分子)雙重作用,從而使生物體產(chǎn)生死亡、自由基間接損傷、染色體重復(fù)、易位、倒位或使DNA分子斷裂、堿基缺失等多種生物學(xué)效應(yīng)。因此,離子注入誘變可得到較高的突變率,且突變譜廣,死亡率低,正突變率高,性狀穩(wěn)定［5］。
二．化學(xué)誘變
化學(xué)誘變劑主要有烷化劑(包括EMS、EI、NEU、NMU、DES、MNNG、NTG等),天然堿基類似物,氯化鋰、亞硝基化合物、疊氮化物、堿基類似物、抗生素、羥胺和吖啶等嵌入染料。
1烷化劑
烷化劑通常帶有1個(gè)或多個(gè)活性烷基,此基團(tuán)能夠轉(zhuǎn)移到其它電子密度高的分子上去,使堿基許多位置上增加了烷基,從而在多方面改變氫鍵的能力。例如EMS被證明是最為有效而且負(fù)面影響小的誘變劑。與其他烷化誘變劑類似,是通過(guò)與核苷酸中的磷酸、嘌呤和嘧啶等分子直接反應(yīng)來(lái)誘發(fā)突變。EMS誘發(fā)的突變主要通過(guò)兩個(gè)步驟來(lái)完成,首先鳥(niǎo)嘌呤的O6位置被烷基化,成為一個(gè)帶正電荷的季銨基團(tuán),從而發(fā)生兩種遺傳效應(yīng):一是烷化的鳥(niǎo)嘌呤與胸腺嘧啶配對(duì),代替胞嘧啶,發(fā)生轉(zhuǎn)換型的突變;二是由于鳥(niǎo)嘌呤的N27烷基活化,糖苷鍵斷裂造成脫嘌而后在DNA復(fù)制過(guò)程中,烷基化鳥(niǎo)嘌呤與胸腺嘧啶配對(duì),導(dǎo)致堿基替換,即G∶C變?yōu)锳∶T。當(dāng)然,化學(xué)誘變存在著染色體結(jié)構(gòu)和數(shù)量方面的誘導(dǎo)變異,但這種單一堿基對(duì)改變而形成的點(diǎn)突變仍是化學(xué)誘變的主要形式。另外，誘變劑也可與核苷結(jié)構(gòu)的磷酸反應(yīng),形成酯類而將核苷酸從磷酸與糖分子之間切斷,產(chǎn)生染色體的缺失。這些DNA結(jié)構(gòu)上的變化都可能促使不表達(dá)的基因或區(qū)段被激活,而表現(xiàn)出被掩蓋的性狀。
另外NTG也是最有效,用得最廣泛的化學(xué)誘變劑之一.依靠NTG誘發(fā)的突變主要是GC—AT轉(zhuǎn)換,另外還有小范圍切除、移碼突變及GC對(duì)的缺失.在自然條件下NTG容易分解,而在酸性(PH5.5)條件下會(huì)產(chǎn)生HNO2.雖然HNO2本身就是誘變劑,但在NTG有活性時(shí)(PH6~9),它卻無(wú)誘變效果.在堿性條件下,NTG會(huì)形成重氮甲烷(CH2N2),它是引起致死和突變的主要原因.它的效應(yīng)很可能是CH2N2對(duì)DNA的烷化作用引起的［6］。
2天然堿基類似物
堿基類似物是與DNA正常堿基結(jié)構(gòu)類似的化合物,能在DNA復(fù)制時(shí)取代正常堿基摻入并與互補(bǔ)堿基配對(duì)。如5-溴尿嘧啶(BU)和2-氨基嘌呤(AP),都能引起AT堿基對(duì)轉(zhuǎn)換為GC堿基對(duì)。
3氯化鋰
氯化鋰誘變，普遍認(rèn)為是它導(dǎo)致AT-GC堿基對(duì)的轉(zhuǎn)換或?qū)е聣A基的缺失。
4疊氮化物
如疊氮化鈉( NaN3)NaN3等電點(diǎn)是pH=4. 18,在pH=3時(shí)NaN3溶液中主要產(chǎn)生呈中性的分子HN3,易透過(guò)膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),以堿基替換方式影響DNA的正常合成,從而導(dǎo)致點(diǎn)突變的產(chǎn)生。NaN3具有高效、無(wú)毒、便宜及使用安全等優(yōu)點(diǎn)。
5抗生素
如平陽(yáng)霉素(PYM)，PYM是一種抗生素,屬于博萊霉素的一類。目前主要作為抗腫瘤藥應(yīng)用于臨床,對(duì)多種癌癥具有較好的療效?？股鼐哂懈叨冗x擇性,能抑制細(xì)胞的生長(zhǎng),其中的大多數(shù)對(duì)維持生命有重要意義。作為一種新的誘變劑, 平陽(yáng)霉素能直接作用于DNA,高濃度時(shí)可使DNA鏈斷開(kāi),低濃度時(shí)能抑制連接酶,阻止胸腺嘧啶核苷酸聚合入DNA,故抑制DNA的修復(fù)合成，PYM在許多實(shí)驗(yàn)中均被證明具有安全、高效、誘變頻率高、范圍大等特點(diǎn)。與EMS的誘變特點(diǎn)相近,在某些方面優(yōu)于EMS,很具有開(kāi)發(fā)和應(yīng)用前景［7］。
6嵌入染料
如吖啶橙、溴化乙錠(EB)等可插入到DNA堿基對(duì)之間的染料,被稱作嵌入燃料，也是較強(qiáng)的誘變劑,能造成兩條鏈錯(cuò)位或移碼突變。
三．空間技術(shù)誘變
近年來(lái)，人們利用宇宙系列生物衛(wèi)星、科學(xué)返回衛(wèi)星、空間站及航天飛機(jī)等空間飛行器，進(jìn)行搭載微生物材料的空間誘變育種。通過(guò)外層空間特殊的物理化學(xué)環(huán)境，引起菌種的DNA 分子的變異和重組，從而得到生物效價(jià)更高的高產(chǎn)菌種。1987年以來(lái),中國(guó)科學(xué)院微生物研究所等單位,先后利用衛(wèi)星搭載了真菌、酵母、放線菌、細(xì)菌等30多種微生物菌種,經(jīng)培殖后觀察發(fā)現(xiàn),處理后菌種的性狀均產(chǎn)生了一些變異,從中選擇培育出了一些能提高抗生素和酶產(chǎn)量的新菌種,現(xiàn)已投產(chǎn)應(yīng)用。
空間環(huán)境導(dǎo)致作物遺傳變異的原因尚不完全清楚,一般認(rèn)為空間誘變的主要因素有以下幾點(diǎn)。
1．微重力假說(shuō) 在衛(wèi)星近地面空間條件下,環(huán)境重力明顯不同于地面,不及地面重力十分的微重力是影響飛行生物生長(zhǎng)發(fā)育的重要因素之一，研究表明，微重力可能干擾DNA損傷修復(fù)系統(tǒng)的正常運(yùn)行，即阻礙或抑制DNA斷鏈的修復(fù)。
2空間輻射假說(shuō) 衛(wèi)星飛行空間存在著各種質(zhì)子、電子、離子、粒子、高能重粒子(HZE)、X—射線、γ-射線及其他宇宙射線。這些射線和粒子能穿透宇宙飛行器外壁,作用于飛行器內(nèi)的生物,產(chǎn)生很高的生物效應(yīng)和有效的誘變作用。
3 轉(zhuǎn)座子假說(shuō)
隨著基因組研究的深入和發(fā)展,中國(guó)科學(xué)院遺傳研究所的專家發(fā)現(xiàn)了新的誘變機(jī)制,即轉(zhuǎn)座子假說(shuō)。該假說(shuō)認(rèn)為,太空環(huán)境將潛伏的轉(zhuǎn)座子激活,活化的轉(zhuǎn)座子通過(guò)移位、插入和丟失,導(dǎo)致基因變異和染色體畸變。這一新的發(fā)現(xiàn)為航天誘變育種機(jī)理研究增加了新的內(nèi)容,加速了航天誘變育種機(jī)理的研究進(jìn)程［8］。
四．復(fù)合誘變
某一菌株長(zhǎng)期使用誘變劑之后,除產(chǎn)生誘變劑“疲勞效應(yīng)”外,還會(huì)引起菌種生長(zhǎng)周期延長(zhǎng)、孢子量減少、代謝減慢等,這對(duì)發(fā)酵工藝的控制不利,在實(shí)際生產(chǎn)中多采用幾種誘變劑復(fù)合處理、交叉使用的方法進(jìn)行菌株誘變。
復(fù)合誘變包括:兩種或多種誘變劑的先后使用，同一種誘變劑的重復(fù)作用和兩種或多種誘變劑的同時(shí)使用.普遍認(rèn)為,復(fù)合誘變具有協(xié)同效應(yīng).如果兩種或兩種以上誘變劑合理搭配使用復(fù)合誘變較單一誘變效果好. 如賀筱蓉等采用紫外同平板梯度濃度的亞硝基胍、純銅蒸氣混合誘變，篩選到高產(chǎn)菌株效價(jià)提高了53.2%，其原理可能是激光對(duì)經(jīng)理化處理的微生物細(xì)胞有修復(fù)作用，使正突變率提高。但也有復(fù)合誘變使效果降低的例子。如吳振倡等在相同的條件下銅蒸氣輻照龜裂鏈霉菌比其隨后又用氯化鋰復(fù)合處理效果好，可能是與氯化鋰提高了細(xì)胞的修復(fù)系統(tǒng)的活性有關(guān)［9］。
復(fù)合因子較單一因子誘變效果有很大優(yōu)勢(shì).但因目前大多微生物,尤其是抗生素產(chǎn)生菌的遺傳背景不清楚,往往對(duì)誘變劑,特別是復(fù)合誘變劑的選擇使用,帶有很大的盲目性。
誘變的目的是為了得到新的突變。在摩爾根時(shí)代，遺傳學(xué)研究?jī)?nèi)容的豐富與新突變的發(fā)現(xiàn)息息相關(guān)。現(xiàn)在，遺傳學(xué)研究的內(nèi)容和手段與過(guò)去相比早已面目全非了，但獲得新突變并從中選出對(duì)人類有利的突變型仍然是熱點(diǎn)之一。培育新品種的方法現(xiàn)在已有許多新手段，如應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)培育轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物等，但誘變育種仍不失為簡(jiǎn)便易行的常用手段。
繆勒不僅是人工誘變的創(chuàng)始人，也是第一位成功的誘變育種家。其實(shí)，他培育的CIB果蠅品系就是一個(gè)非常有用的果蠅新品種。20世紀(jì)30年代，瑞典的古斯塔夫松（Gustafsson）、尼布姆（Nybom）和哈格貝里（Hagbery）等就開(kāi)始致力于誘變育種工作，并取得了較大成就。到50年代，瑞典已成為世界放射誘變育種研究的中心。60-70年代，誘變育種工作已成燎原之勢(shì)，經(jīng)誘變而得到的新品種已數(shù)不勝數(shù)。我國(guó)在60年代初開(kāi)始誘變育種工作，進(jìn)入80年代后，誘變育種工作與我國(guó)其它行業(yè)一樣進(jìn)入了鼎盛時(shí)期。誘變育種的成果主要體現(xiàn)在作物育種和微生物育種兩方面。作物育種，目標(biāo)致力于早熟、抗病、高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)。這些目標(biāo)并不是一下子就能達(dá)到的，特別是與某些品質(zhì)有一定的相關(guān)性，如早熟的難以高產(chǎn)，高產(chǎn)的不早熟，這就須一步步地進(jìn)行?？梢杂镁哂心撤N優(yōu)良品質(zhì)的品種作基礎(chǔ)，通過(guò)誘變，從中選出保持（甚至超過(guò)）該優(yōu)秀品質(zhì)并出現(xiàn)新的優(yōu)良品質(zhì)的突變體。如浙江培育的早熟水稻“原豐早”，就是以“科字6號(hào)”為基礎(chǔ)，經(jīng)誘變選擇而育成的?！霸S早”穗大粒多，耐肥抗倒，保留了“科字6號(hào)”的豐產(chǎn)品質(zhì)，但比后者早熟45天，從而產(chǎn)量比成熟期相同的其它品種高一成以上。“原豐早”還有適應(yīng)性廣、早晚季均可種植、二熟制或三熟制都能適應(yīng)的優(yōu)點(diǎn)。這類例子舉不勝舉，如湖北育成的“鄂麥6號(hào)”、山東育成的“魯棉1號(hào)”、黑龍江育成的“黑農(nóng)16號(hào)”大豆、廣東育成的“獅選64號(hào)”花生等，都是應(yīng)用誘變而培育成功的。微生物育種，目標(biāo)在于獲得高產(chǎn)菌株。許多生化藥物如核苷酸、酶制劑、氨基酸、抗生素等，常常用微生物發(fā)酵法來(lái)進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)。由于許多生化成分在生物組織中的含量較低、提取較為困難，所以這類藥物價(jià)格極昂貴。如果某種微生物代謝途徑改變，能累積這類成分，那么即可利用這種微生物來(lái)大量生產(chǎn)藥物。工業(yè)化生產(chǎn)的最大優(yōu)點(diǎn)是能大幅度降低藥物的生產(chǎn)成本，而誘變育種可以逐漸提高藥物產(chǎn)量，從而進(jìn)一步降低成本。在我國(guó)許多生化制藥廠的抗生素生產(chǎn)車間里，都有著一批專門從事菌種培育的技術(shù)人員。正是由于他們的辛勤勞動(dòng)，才使得各地的生產(chǎn)水平逐年提高。通過(guò)誘變育種，使藥物產(chǎn)量逐漸提高成千上萬(wàn)倍的例子屢見(jiàn)不鮮。
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