臨床生物化學/分析性超速離心

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臨床生物化學

常用分析技術(shù)在臨床生物化學中的應(yīng)用
- 離心技術(shù)的應(yīng)用
  - 基本原理的分類
  - 離心分離方法
  - 分析性超速離心

與制備性超速離心不同的是：分析性超速離心主要是為了研究生物大分子的沉降特性和結(jié)構(gòu)，而不是專門收集某一特定組份。因此它使用了特殊的轉(zhuǎn)子和檢測手段，以便連續(xù)監(jiān)視物質(zhì)在一個離心場中的沉降過程。

（一）分析性超速離心的工作原理

分析性超速離心機主要由一個橢圓形的轉(zhuǎn)子、一套真空系統(tǒng)和一套光學系統(tǒng)所組成。該轉(zhuǎn)子通過一個柔性的軸聯(lián)接成一個高速的驅(qū)動裝置，此軸可使轉(zhuǎn)子在旋轉(zhuǎn)時形成自己的軸。轉(zhuǎn)子在一個冷凍的真空腔中旋轉(zhuǎn)，其容納二個小室：分析室和配衡室。配衡室是一個經(jīng)過精密加工的金屬塊，作為分析室的平衡用。分析室的容量一般為1ml，呈扇形排列在轉(zhuǎn)子中，其工作原理與一個普遍水平轉(zhuǎn)子相同。分析室有上下二個面的石英窗，離心機中裝有的光學系統(tǒng)可保證在整個離心期間都能觀察小室中正在沉降的物質(zhì)，可以通過對紫外光的吸收（如對蛋白質(zhì)和DNA）或折謝率的不同對沉降物進行監(jiān)視。后一方法的原理是：當光線通過一個具有不同密度區(qū)的透明液，在這些區(qū)帶的界面上產(chǎn)生光的折射。在分析室中物質(zhì)沉降時重粒子和輕粒子之間形成的界面就象一個折射的透鏡，結(jié)果在檢測系統(tǒng)的照相底板上產(chǎn)出一“峰”。由于沉降不斷進行，界面向前推進，故“峰”也在移動，從峰移動的速度可以得到物質(zhì)沉降速度的指標。圖16-5是分析性超速離心系統(tǒng)的示意圖。

（二）分析性超速離心的應(yīng)用

⒈測定生物大分子的相對分子重量測定相對分子重量主要有三種方法：沉降速度、沉降平衡和接近沉降平衡。其中應(yīng)用最廣的是沉降速度，超速離心在高速中進行，這個速度使得任意分布的粒子通過溶劑從旋轉(zhuǎn)的中心輻射地向外移動，在清除了粒子的那部分溶劑和尚含有沉降物的那部分溶劑之間形成一個明顯的界面，該界面隨時間的移動而移動，這就是粒子沉降速度的一個指標，然后用照相記錄，即可求出粒子的沉降系數(shù)。

分子或粒子的相對分子重量則可從Svedberg方程式來確定：

分析性超速離心系統(tǒng)圖示

圖16-5　分析性超速離心系統(tǒng)圖示

式中M：該分子不含水的相對分子重量；R：氣體常數(shù)；T：絕對溫度；S：分子的沉降系數(shù)；ν：分子的微分比容（當一克溶質(zhì)加到一個大體積的溶液中所占有的體積）；ρ：溶劑的密度。

⒉生物大分子的純度估計靜分析性超速離心已廣泛地應(yīng)用于研究DNA制劑、病毒和蛋白質(zhì)的純度。用沉降速度的技術(shù)來分析沉降界面是測定制劑均質(zhì)性的最常用方法之一，出現(xiàn)單一清晰的界面一般認為是均質(zhì)的，如有雜質(zhì)則在主峰的一側(cè)或二側(cè)出現(xiàn)小峰。

⒊分析生物大分子中的構(gòu)象變化分析性超速離心已成功地用于檢測大分子構(gòu)象的變化，例如DNA可能以單股或雙股出現(xiàn)，其中每一股在本質(zhì)上可能是線性的，也可能是環(huán)狀的，如果遇到某種因素（溫度或有機溶劑）DNA分子可能發(fā)生一些構(gòu)象上的變化，這些變化也許可逆、也許不可逆，這些構(gòu)象上的變化可以通過檢查樣品在沉降速度上的差異來證實。