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臨床生物化學(xué)

常用分析技術(shù)在臨床生物化學(xué)中的應(yīng)用 離心技術(shù)的應(yīng)用 基本原理的分類(lèi) 離心分離方法 分析性超速離心

臨床生物化學(xué)目錄

（一）基本原理

⒈離心力（centrifugal force，F(xiàn)c）離心作用是根據(jù)在一定角度速度下作圓周運(yùn)動(dòng)的任何物體都受到一個(gè)向外的離心力進(jìn)行的。離心力（Fc）的大小等于離心加速度ω²X與顆粒質(zhì)量m的乘積，即：

其中ω是旋轉(zhuǎn)角速度，以弧度/秒為單位；X是顆粒離開(kāi)旋轉(zhuǎn)中心的距離，以cm為單位；m是質(zhì)量，以克為單位。

⒉相對(duì)離心力（relative centrifugal force，RCF）由于各種離心機(jī)轉(zhuǎn)子的半徑或者離心管至旋轉(zhuǎn)軸中心的距離不同，離心力而受變化，因此在文獻(xiàn)中常用“相對(duì)離心力”或“數(shù)字×g”表示離心力，只要RCF值不變，一個(gè)樣品可以在不同的離心機(jī)上獲得相同的結(jié)果。

RCF就是實(shí)際離心場(chǎng)轉(zhuǎn)化為重力加速度的倍數(shù)。

式中X為離心轉(zhuǎn)子的半徑距離，以cm為單位；g為地球重力加速度（980cm/sec²）；n為轉(zhuǎn)子每分鐘的轉(zhuǎn)數(shù)（rpm）。

在上式的基礎(chǔ)上，Dole和Cotzias制作了與轉(zhuǎn)子速度和半徑相對(duì)應(yīng)的離心力的轉(zhuǎn)換列線圖，見(jiàn)圖16-4，在用圖16-4將離心機(jī)轉(zhuǎn)數(shù)換成相對(duì)離心力時(shí)，先在離心機(jī)半徑標(biāo)尺上取已知的離心機(jī)半徑和在轉(zhuǎn)數(shù)標(biāo)尺上取已知的離心機(jī)轉(zhuǎn)數(shù)，然后將這兩點(diǎn)間劃一條直線，在圖中間RCF標(biāo)尺上的交叉點(diǎn)，即為相應(yīng)的離心力數(shù)值。例已知離心機(jī)轉(zhuǎn)數(shù)為2500rpm，離心機(jī)的半徑為7.7cm，將兩點(diǎn)連接起來(lái)交于RCF標(biāo)尺，此交點(diǎn)500×g即是RCF值。

⒊沉降系數(shù)（sedimentation coefficient，s）根據(jù)1924年Svedberg對(duì)沉降系數(shù)下的定義：顆粒在單位離心力場(chǎng)中粒子移動(dòng)的速度。

若ω用2πn/60表示，則

式中X₁為離心前粒子離旋轉(zhuǎn)軸的距離；X₂為離心后粒子離旋轉(zhuǎn)軸的距離。S實(shí)際上時(shí)常在10^-13秒左右，故把沉降系數(shù)10^-13秒稱(chēng)為一個(gè)Svedberg單位，簡(jiǎn)寫(xiě)S，量綱為秒。

⒋沉降速度（sedimentation velocity）沉降速度是指在強(qiáng)大離心力作用下，單位時(shí)間內(nèi)物質(zhì)運(yùn)動(dòng)的距離。

式中r為球形粒子半徑；d為球形粒子直徑；η為流體介質(zhì)的粘度；ρ_P為粒子的密度；ρ_m為介質(zhì)的密度。

從上式可知，粒子的沉降速度與粒子直徑的平方、粒子的密度和介質(zhì)密度之差成正比；離心力場(chǎng)增大，粒子的沉降速度也增加，將此式代入上項(xiàng)沉降系數(shù)公式中，則S的表示式也可表示為：

從該式中可看出，①當(dāng)ρ_P＞ρ_m，則S＞0，粒子順著離心方向沉降。②當(dāng)ρ_P＝ρ_m，則S＝0，粒子到達(dá)某一位置后達(dá)到平衡。③當(dāng)ρ_P＜ρ_m，則S＜0，粒子逆著離心方向上浮。

⒌沉降時(shí)間（sedimentation time，Ts）在實(shí)際工作中，常常遇到要求在已有的離心機(jī)上把某一種溶質(zhì)從溶液中全部沉降分離出來(lái)的問(wèn)題，這就必須首先知道用多大轉(zhuǎn)速與多長(zhǎng)時(shí)間可達(dá)到目的。如果轉(zhuǎn)速已知，則需解決沉降時(shí)間來(lái)確定分離某粒子所需的時(shí)間。

根據(jù)沉降系數(shù)（S）式可得：

圖16-4　離心力的轉(zhuǎn)換列線圖

將左側(cè)r點(diǎn)與右側(cè)n點(diǎn)連成一條直線，與中間RCF相交的

點(diǎn)即為相對(duì)離心力(×g)RCF=1.118×10²×r×n²。

積分得

式中X₂為離心轉(zhuǎn)軸中心至離心管底內(nèi)壁的距離；X₁為離心轉(zhuǎn)軸至樣品溶液彎月面之間的距離，那么樣品粒子完全沉降到底管內(nèi)壁的時(shí)間（t₂－t₁）用Ts表示則式可改為：

式中Ts以小時(shí)為單位，S以Svedberg為單位。

⒍K系數(shù)（k factor） K系數(shù)是用來(lái)描述在一個(gè)轉(zhuǎn)子中，將粒子沉降下來(lái)的效率。也就是溶液恢復(fù)成澄清程度的一個(gè)指數(shù)，所以也叫“cleaning factor”。原則上，K系數(shù)愈小的，愈容易，也愈快將粒子沉降。

其中R_max為轉(zhuǎn)子最大半徑；R_min為轉(zhuǎn)子最小半徑。由其公式可知，K系數(shù)與離心轉(zhuǎn)速及粒子沉降的路徑有關(guān)。所以K系數(shù)是一個(gè)變數(shù)。當(dāng)轉(zhuǎn)速?gòu)U，或者離心管的溶液量不同，即粒子沉降的路徑改變時(shí)，K系數(shù)就改變了。通常，離心機(jī)的轉(zhuǎn)子說(shuō)明書(shū)中提供的K系數(shù)，都是根據(jù)最大路徑及在最大轉(zhuǎn)速下所計(jì)算出來(lái)的數(shù)值。如果已知粒子的沉降系數(shù)為80S的Polysome，采用的轉(zhuǎn)子的K系數(shù)是323，那么預(yù)計(jì)沉降到管底所需的離心時(shí)間是T＝k/S＝4h，利用此公式預(yù)估的離心時(shí)間，對(duì)水平式轉(zhuǎn)子最適合；對(duì)固定角式轉(zhuǎn)子而言，實(shí)際時(shí)間將比預(yù)估的時(shí)間來(lái)得快些。

（二）分類(lèi)

根據(jù)離心原理，按照實(shí)際工作的需要，目前已設(shè)計(jì)出許多離心方法，綜合起來(lái)大致可分三類(lèi)。

⒈平衡離心法根據(jù)粒子大小、形狀不同進(jìn)行分離，包括差速離心法（differential velocitycentrifugation）和速率區(qū)帶離心法（rate zonal centrifugation）。

⒉等密度離心法（jsopycnic centrifugation）又稱(chēng)等比重離心法，依粒子密度差進(jìn)行分離，等密度離心法和上述速率區(qū)帶離心法合稱(chēng)為密度梯度離心法。

⒊經(jīng)典式沉降平衡離心法用于對(duì)生物大分子分子量的測(cè)定、純度估計(jì)、構(gòu)象變化等。

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