臨床生物化學(xué)/影響光譜分析的主要因素

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臨床生物化學(xué)

常用分析技術(shù)在臨床生物化學(xué)中的應(yīng)用
- 光譜分析技術(shù)的應(yīng)用
  - 光譜分析技術(shù)的分類
  - 光譜分析的常用方法
  - 影響光譜分析的主要因素

光譜分析的基礎(chǔ)是被測(cè)物質(zhì)的濃度與吸亮度成正比，但在實(shí)際測(cè)定中，往往容易發(fā)生偏離直線的現(xiàn)象而引入誤差，導(dǎo)致誤差的主要原因有化學(xué)因素、主觀因素和光學(xué)因素等三類。

（一）化學(xué)因素

化學(xué)因素是指被測(cè)溶液不遵守光吸收定律所引起的誤差。主要有以下幾種影響。

1、被測(cè)物濃度的影響由于有色物質(zhì)的電離、水解、締合等原因，當(dāng)溶液稀釋或增濃時(shí)，有色物質(zhì)顏色的深淺并不按比例降低或增高，因而也就不完全符合光吸收定律。

2、溶液pH的影響有些溶液的顏色對(duì)pH值的改變十分敏感，因而溶液pH不同時(shí)常會(huì)產(chǎn)生誤差，如溴甲酚綠法測(cè)定血清白蛋白。

3、雜質(zhì)的影響如被測(cè)物溶液中含有雜質(zhì)而且這種雜質(zhì)本身是有色的，或能和顯色劑生成有色化合物或沉淀，或能與被測(cè)物質(zhì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)等，都會(huì)影響吸光度的變化。

4、放置時(shí)間的影響某些有色物質(zhì)能迅速生成，但卻不太穩(wěn)定，放置后色澤消退或起變化，而另一些有色物質(zhì)須經(jīng)過(guò)相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間后，反應(yīng)才能完全，因此，若在不恰當(dāng)?shù)臅r(shí)間內(nèi)進(jìn)行比色，將會(huì)造成相當(dāng)大的誤差。

此外，還有溶劑、溫度、溶液體系的均勻性等都會(huì)引起測(cè)定的誤差。

（二）主觀因素

由于操作不當(dāng)，特別是在分離、稀釋和加顯色劑等過(guò)程中，沒(méi)有遵守一定的條件，也會(huì)引入不同程度的誤差。因?yàn)橛行┯猩镔|(zhì)的生成和其顏色的深淺，往往隨加入試劑的量、加入順序、試劑濃度、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間等因素而發(fā)生改變。

（三）光學(xué)因素

光學(xué)因素主要是指分析儀器的性能低劣所引起的誤差，分析儀器應(yīng)用最多的是分光光度計(jì)，它們的性能好壞直接影響到測(cè)定結(jié)果的可靠性和精密性。因此對(duì)分析儀器均應(yīng)有質(zhì)量保證措施，這里主要介紹分光光度的質(zhì)量保證方法。

1、分光光度計(jì)的性能檢查

（1）波長(zhǎng)校正：使用光電比色計(jì)或分光光度計(jì)，在更換光源燈、重新安裝、搬運(yùn)或檢修后，以及儀器工作不正常時(shí)，都要進(jìn)行波長(zhǎng)校正。就是正常工作的儀器，每隔一個(gè)月也要檢查一次波長(zhǎng)，必要時(shí)進(jìn)行校正，這樣才能保證波長(zhǎng)讀數(shù)與通過(guò)樣品的波長(zhǎng)符合，保證儀器的最大靈敏度。方法常用譜釹濾光片校正法，適用于721型儀可見光區(qū)的波長(zhǎng)校正，常以585nm或529nm處的吸收峰或T%為標(biāo)準(zhǔn)。鑒于721型儀器的出射光波長(zhǎng)較寬，不易將573nm和585nm的兩峰或兩谷分開，校正時(shí)易產(chǎn)生誤差，故推薦用529nm處的峰或谷為標(biāo)準(zhǔn)來(lái)進(jìn)行波長(zhǎng)校正。校正時(shí)，將儀器按要求預(yù)熱。要求電源電壓穩(wěn)定。波長(zhǎng)度盤置580nm處，T%調(diào)至最大，在比色杯處放一白紙條，觀察是否有光強(qiáng)均勻、邊緣無(wú)光暈或雜光的光斑，如不符合要求，可調(diào)節(jié)燈泡位置使其符合要求，是為波長(zhǎng)校正的粗調(diào)。再把靈敏度扭置于“1”（最低檔），波長(zhǎng)度盤對(duì)準(zhǔn)529nm，電表機(jī)械零點(diǎn)為零，在光路空白時(shí)調(diào)T%為100%T，并反復(fù)查零點(diǎn)和100%T穩(wěn)定情況。將譜釹濾光片插入光路，慢慢旋轉(zhuǎn)波長(zhǎng)度盤，找到透光率最低的一點(diǎn)（向左右微旋波長(zhǎng)度盤時(shí)，該點(diǎn)透光率值均增加），這一點(diǎn)即為波長(zhǎng)529nm。檢查波長(zhǎng)度盤的指示值是不是529nm，如指示值為534nm，此時(shí)波長(zhǎng)工誤差為5nm，超出規(guī)定（±1nm）必須進(jìn)行調(diào)整。

調(diào)整方法：將波長(zhǎng)度盤對(duì)準(zhǔn)529nm，從光路取出譜釹濾光片，光路空白時(shí)調(diào)電表指針到100%T，再將譜釹濾光片插入光路。打開儀器左側(cè)小蓋板，找到波長(zhǎng)校正螺絲（3個(gè)中左側(cè)柄長(zhǎng)的一個(gè)）；反時(shí)針?lè)较蛭⑽⒄{(diào)節(jié)（負(fù)誤差時(shí)順時(shí)針?lè)较颍?，使電表指針的指示T%為最低。反復(fù)檢查波長(zhǎng)誤差情況，直到符合儀器技術(shù)指標(biāo)為止。蓋好左側(cè)小蓋板，校正結(jié)束。

有些高檔儀器如島津UV-260型雙光束分光光度計(jì)，可使用氫燈或置譜釹濾光片于測(cè)定比色槽內(nèi)，編入濾工掃描程序后，儀器即可自動(dòng)地在一定波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行波長(zhǎng)校正。高檔分光光度儀的光學(xué)系統(tǒng)密封在一個(gè)單元組件內(nèi)，若發(fā)生故障，波長(zhǎng)不準(zhǔn)，常須請(qǐng)制造商派專人修理。其它尚有譜線校正法、干涉濾光片校正法和有色溶液校正法等，可參考有關(guān)資料。

（2）線性檢查：線性檢查包括儀器線性及測(cè)定方法線性兩個(gè)方面的檢查。線性誤差表現(xiàn)為溶液的濃度與吸光度不成線性關(guān)系，出現(xiàn)正偏離或負(fù)偏離的現(xiàn)象。這種偏離，按比耳定律的現(xiàn)象來(lái)自兩個(gè)方面：一是溶液本身不符合比耳定律，這種現(xiàn)象叫做化學(xué)偏離；二是儀器本身各種因素的影響，使吸光度測(cè)定值與濃度之間不成線性關(guān)系，這種現(xiàn)象叫儀器偏離。此處研究的是后者。儀器偏離的因素很多，如雜光、有限帶寬、檢測(cè)器噪聲、環(huán)境條件變化、波長(zhǎng)的變動(dòng)、比色杯的誤差、輻射光的非平行性、檢測(cè)器本身的非線性等。

儀器線性檢查常用一種在一定波長(zhǎng)及一定濃度范圍內(nèi)確知其服從比耳定律的有色物質(zhì)，配成不同濃度的溶液，來(lái)檢查儀器本身是否能如實(shí)地反映有色物質(zhì)的濃度變化。這種檢查方法與任何被測(cè)物質(zhì)呈色反應(yīng)等方法學(xué)上的問(wèn)題無(wú)關(guān)。用測(cè)得的吸光度對(duì)濃度作圖，在理想情況下應(yīng)是一條直線。常用的方法是用0.8、1.6、2.4、4.0mg/L伊文藍(lán)濃度系列來(lái)檢查，波長(zhǎng)用610nm。

（3）雜光（散光）檢查：在吸光度測(cè)定中，凡檢測(cè)器感受到的不需要的輻射都稱為雜光。雜光對(duì)吸光度測(cè)定法的準(zhǔn)確性有嚴(yán)重的影響，但卻往往被忽視。雜光的來(lái)源有：①儀器本身的原因，如單色器的設(shè)計(jì)、光源的光譜分布、光學(xué)原件的老化程度、波帶寬度以及儀器內(nèi)部的反射及散射等；②室內(nèi)光線過(guò)強(qiáng)而漏入儀器，儀器暗室蓋不嚴(yán)；③樣品本身的原因，如樣品有無(wú)熒光、樣品的散射能力強(qiáng)弱等。

雜光檢測(cè)方法：①紫外光區(qū)的雜光監(jiān)測(cè)可用10±0.1g/L的碘化鈉溶液，在240nm處測(cè)定的吸光度應(yīng)大于2.00。此外，也可用12g/L的氯化鉀溶液，在220nm處測(cè)其透光度，即為雜光量，一般應(yīng)小于1%T。以上測(cè)定均用石英杯，以蒸餾水校零。②在可見光區(qū)可使用譜釹濾光片或硫酸鎳法檢查。先用譜釹濾片校正波長(zhǎng)，然后用黑紙片擋住比色杯光路（進(jìn)口儀器帶有比色杯樣黑色標(biāo)柱）之后調(diào)整0%T，再用空氣做空白調(diào)100%T。插入譜釹濾光片，在585nm處測(cè)定，其測(cè)定值即為雜光水平。

（4）比色杯的質(zhì)量檢查：比色杯一般由玻璃、石英或熒石制成，光徑1.0或0.5cm,光線通過(guò)時(shí)有一部分光為空氣與玻璃接觸面的反射而損失（4%），另一部分（很少）為玻璃吸收。比色杯的質(zhì)量除其原料外，再就是玻璃的厚度均勻，上下一致，各杯彼此相配。廠家多以四個(gè)套供應(yīng)，且杯口上部外面標(biāo)有箭頭，箭頭對(duì)光源側(cè)使用。盡管如此，在使用前還是應(yīng)作質(zhì)量檢查。常用伊文藍(lán)法：將一定量的2.0mg/L的伊文藍(lán)溶液注入比色杯中，比色杯內(nèi)液面應(yīng)相等。用一個(gè)比色杯作標(biāo)準(zhǔn)，用紅色濾光片（波長(zhǎng)600～610nm），用水校零后將此杯的讀數(shù)準(zhǔn)確調(diào)至50%T，接著讀取其余杯的透光度。透光度相差在±0.5%T范圍內(nèi)者為合格。

（5）穩(wěn)定性檢查：檢查方法：將分光光度計(jì)及附件接于0.5kVA以上的可調(diào)變壓器，先調(diào)電壓為220V，波長(zhǎng)固定在650nm，在光路比色杯裝以空白液，調(diào)讀數(shù)為90%T處，再將電壓升至230V及降至190V，觀察透光度的漂移值。若介于88.5%～91.5%T之間為合格。在電源電壓不變的條件下，在3分鐘內(nèi)其讀數(shù)漂移不應(yīng)超過(guò)標(biāo)尺上限值的±0.5%。

（6）重復(fù)性檢查：在波長(zhǎng)、工作狀態(tài)、電源電壓、比色杯配套等合格的前提下，進(jìn)行重復(fù)檢查。在用交流電源供電時(shí)，儀器對(duì)一種溶液重復(fù)測(cè)定的讀數(shù)值差應(yīng)小于或等于標(biāo)尺上限值的1%。試驗(yàn)方法：將分析純重絡(luò)酸鉀于120～150攝氏度烘干2小時(shí)，干燥器中冷卻。精稱509.1mg于1000ml容量瓶中，以蒸餾水溶解并加至刻度，混勻（此液180mg/L鉻）。就用液為30、60、180mg鉻/L。取波長(zhǎng)440nm，將應(yīng)用液各濃度管連續(xù)測(cè)3～5次，各濃度管中最大誤差小于1%T為合格。

（7）靈敏度檢查：將重鉻酸鉀液配制成30和32.5mg鉻/L及120和122.5mg/L鉻的4種應(yīng)用液（濃度差兩組各為2.5mg/L鉻）。波長(zhǎng)440nm，以水校零點(diǎn)，將上述應(yīng)用液連續(xù)測(cè)3次吸光度，兩組2.5mg/L鉻濃度差的吸光度值差都不小于0.01為合格。

2、分光光度計(jì)日常工作狀態(tài)監(jiān)測(cè)在可見光區(qū)范圍內(nèi)，用一種有色溶液檢查儀器是否處于較好的工作狀態(tài)（包括波長(zhǎng)、雜光水平等），常用硫酸鎳水溶液。該液在400～700nm之間有吸收峰，峰值在510nm。檢查時(shí)，在400、460、510、550及570nm處測(cè)定硫酸鎳溶液的透光度值，記錄并保存。待一定時(shí)間后用該溶液再檢測(cè)。比較前后兩次的數(shù)據(jù)，即可知儀器的工作狀態(tài)。

硫酸鎳溶液的制備：將硫酸鎳溶于0.1%的硫酸中，用量的多少以在510nm測(cè)得的透光度達(dá)80%T為準(zhǔn)，以0.1%硫酸校零點(diǎn)，配好后密封備用。

監(jiān)測(cè)的意義：在400、700nm處的測(cè)定可以監(jiān)測(cè)雜光，這些波長(zhǎng)處的測(cè)定值升高說(shuō)明雜光增加，其中任一值增加3%就需要進(jìn)行檢修。510nm處的測(cè)定值可以監(jiān)測(cè)帶寬，這個(gè)波長(zhǎng)的測(cè)定值減小說(shuō)明帶寬加大。光源強(qiáng)度減弱或波長(zhǎng)不準(zhǔn)可以產(chǎn)生這種結(jié)果，如降低2%T，對(duì)于帶寬為20nm的儀器就需要修理。460與550nm處的讀數(shù)主要作為監(jiān)測(cè)波長(zhǎng)之用，稱二次波長(zhǎng)校正。這兩個(gè)波長(zhǎng)的讀數(shù)相互關(guān)聯(lián)，一個(gè)升高另一個(gè)就降低。如460nm的測(cè)定值（透光度）降低，而550nm的測(cè)定值升高，說(shuō)明透過(guò)比色杯樣品的波長(zhǎng)小于波長(zhǎng)度盤指示的波長(zhǎng)（圖16-2左）。反之，如460nm的測(cè)定值升高，而550的測(cè)定值降低，說(shuō)明透過(guò)比色杯樣品的波長(zhǎng)大于波長(zhǎng)度盤指示的波長(zhǎng)（圖16-2右）。

硫酸鎳溶液監(jiān)測(cè)儀器工作狀態(tài)

圖16-2 硫酸鎳溶液監(jiān)測(cè)儀器工作狀態(tài)

實(shí)線代表波長(zhǎng)正確時(shí)的吸收光譜，虛線代表波長(zhǎng)不正確時(shí)的吸收光譜。箭頭1表示510nm處的透光度，左右圖均下降；箭頭2表示460nm處的透光度，左圖下降，右圖升高，箭頭3表示550處的透光度，左圖升高，右圖下降。

儀器工作狀態(tài)測(cè)定后，若波長(zhǎng)與雜光符合要求時(shí)，記錄并保存各項(xiàng)數(shù)據(jù)，以備以后測(cè)定時(shí)對(duì)比。一般應(yīng)每月監(jiān)測(cè)一次，當(dāng)400nm及700nm處雜光增強(qiáng)時(shí)，可能的原因包括：①激發(fā)光源陳舊，變黑或表層模糊不清。②透鏡有灰塵。③色散元件失效等。如510nm處透光度減弱，可能原因?yàn)楣庠礋艚z故障，比色池出光縫失靈或光柵損壞。