臨床生物化學(xué)/測定方法、標(biāo)本處理等對測定結(jié)果的影響
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除了生理條件可引起酶測定值的變化外,還有其它一些非病理因素也會引起實驗室測定結(jié)果的變化。
(一)酶測定方法
酶測定方法大致經(jīng)過三個歷史發(fā)展階段,50年代以前大都使用“固定時間法”,即讓酶與底物作用一段固定時間,一般為半小時左右,然后停止酶反應(yīng),用光電比色測產(chǎn)物生成量或底物消耗量,從而計算出酶催化反應(yīng)的平均速度。再據(jù)此按各作者自己定義的“單位”向臨床報告測定結(jié)果。這些所報的單位往往在前面冠以作者的姓名命名,例如ALP根據(jù)不同測定方法就有金氏單位、鮑氏單位、國際單位等等。同一標(biāo)本不同單位結(jié)果從表面數(shù)值看可以差異很大。如ALP上列三種單位參考值分別為3-13金氏單位,0-3鮑氏單位,20-80國際單位。
50年代中期,國際臨床實驗室開始采用“連續(xù)監(jiān)測法”,就是習(xí)慣上所稱的“動態(tài)法”。需要使用生化分析儀,可以測酶反應(yīng)的初速度,其結(jié)果遠(yuǎn)比“固定時間法”所測平均速度準(zhǔn)確,在高濃度標(biāo)本時尤為明顯。這樣同一疾病患者用兩種方法所測酶的結(jié)果并不一定平行一致。在疾病急性期,用新法測定結(jié)果增加倍數(shù)常明顯超過老法。例如在肝炎用賴氏法測ALT很少超過參考值上限的十倍。改用新法,在肝炎急性期可得到超過參考值上限數(shù)十倍乃至百倍以上的結(jié)果,由于后者結(jié)果和臨床病理變化相一致,結(jié)果準(zhǔn)確。目前在發(fā)達(dá)國家中,新法已幾乎取代了老法,我國也已開始廣泛應(yīng)用新法。本書各論在討論各種疾病酶變化時,將主要根據(jù)新法加以敘述。用新法也就是“連續(xù)監(jiān)測法”所得結(jié)果,目前已基本統(tǒng)一使用1964年國際生化協(xié)會所規(guī)定的國際單位(IU):即以每分鐘能催化1微摩爾底物的酶量為1個國際單位。如表示血清中酶濃度多以U/L表示之,即IL標(biāo)本(血清)中含的酶量,我國醫(yī)學(xué)界對此表示方法已經(jīng)熟悉習(xí)慣。我國現(xiàn)在規(guī)定SI制為計量的法定單位,SI制的酶單位為Katal,即每秒能催化1總分子底物的酶量為1個Katal,此單位不僅我國醫(yī)學(xué)家不熟悉,國際上應(yīng)用不多,如有可能可同時用兩種單位報告結(jié)果,或者注明轉(zhuǎn)換系數(shù),即1U=16.67μKatal。
但即使同使用連續(xù)監(jiān)測法,同用IU/L報告結(jié)果,不同實驗室測定結(jié)果仍可出現(xiàn)較大差異。這是因為上述二法是通過測酶催化速度來間接表示酶量高低,而酶催化的速度還受很多其它因素影響。首先是溫度,在國際單位定義中并未規(guī)定測定溫度,而反應(yīng)速度隨溫度升高而加速,一般說每增加10℃,反應(yīng)速度將增加一倍。因此同一標(biāo)本、同一方法,在37℃所得結(jié)果將顯著高于30℃。雖然國際臨床化學(xué)協(xié)會(IFCC)推薦30℃為酶測定溫度,但臨床實驗室由于實驗工作方便等因素,愈來愈多使用37℃。因此本書各酶測定參考值將以37℃所測結(jié)果為準(zhǔn),某些數(shù)據(jù)如在30℃測定將在結(jié)果后面用(30℃)表示。
除溫度外,測定時條件的不同也可能引起結(jié)果明顯差異。最突出例子是ALP測定,用二乙醇胺為緩沖液測出ALP結(jié)果比用氨基甲基丙烷為緩沖液的高2-3倍。又如在ALT測定時,如在底物中加入磷酸吡哆醛比不加者結(jié)果可增高20%-100%。正因為如此,為防止臨床醫(yī)生產(chǎn)生錯覺,認(rèn)為IU/L結(jié)果在國際上應(yīng)一致。目前實驗室常以U/L,而不以IU/L向臨床報告。
總之,臨床醫(yī)師在分析酶測定結(jié)果(U/L)時應(yīng)以給報告實驗室的參考值為準(zhǔn),盲目套用文獻(xiàn)結(jié)果或與其它實驗室結(jié)果相比較,有可能得到不恰當(dāng)?shù)慕Y(jié)論。
前面已提到從70年代以來,隨免疫技術(shù)發(fā)展,出現(xiàn)利用酶的抗原性,通過抗原抗體反應(yīng)直接測定酶的質(zhì)量。測定結(jié)果不是以U/L報告而是直接用ng/ml,μg/L等報告酶蛋白含量高低。如臨床醫(yī)師看到這樣的報告,就可知道此時使用了最新的免疫學(xué)方法測酶,其臨床意義有可能與前兩種方法結(jié)果有差異。例如國外公認(rèn),同樣測CK-MB,用免疫學(xué)方法所測結(jié)果診斷價值最高,此問題將在后專門敘述。
(二)標(biāo)本的采集、處理與貯存
在實驗室測定酶之前,標(biāo)本還要經(jīng)過采集、分離血清和貯存等一系列處理過程。而酶在血中是處于一個動態(tài)變化過程,血液離開體內(nèi)后,還會有一定變化。因此在其中任何一個階段處理不當(dāng),都有可能引起測定值變化。
采取血液標(biāo)本時最容易引起實驗室誤差的是抽血不當(dāng),或者實驗室急于分離血清,因此體外溶血。由于大部分酶在細(xì)胞內(nèi)外濃度差異明顯,少量血細(xì)胞的破壞就有可能引起血清中酶明顯升高。最明顯例子是LD,紅細(xì)胞中LD約為血清的100倍,這樣,只要有輕度溶血,如1/100紅細(xì)胞破壞,就足以使血清中LD升高一倍,常使原為正常的血清LD值超過參考值上限。其它如CK,雖然紅細(xì)胞中無CK,但含有豐富腺苷酸激酶(AK),進(jìn)入血清能使某些用“連續(xù)監(jiān)測法”測定CK的值假性升高,紅細(xì)胞中酶的干擾,不僅表現(xiàn)在溶血影響上,采血后如不及時將血清和血凝塊分離,血細(xì)胞中酶同樣可以透過細(xì)胞膜進(jìn)入血清,所以采血后1-2小時實驗室必須及時離心,分離血清。
除非測定與凝血或纖溶有關(guān)的酶,一般都不采用血漿而采用血清作為測定標(biāo)本。大多數(shù)抗凝劑都在一定程度上影響酶活性,例如EDTA為金屬離子螯合劑,在去除Ca2+同時也去除其中Mg2+、Mn2+等離子,Mg2+是ALP、CK和5′-核苷酸酶(5′-NA)作用的激活劑,其它如草酸鹽、枸櫞酸鹽乃至肝素都對一些酶有一定程度抑制。有必要時,可考慮使用肝素為抗凝劑,在常用抗凝劑中它對酶影響最小的。
酶蛋白不穩(wěn)定,易失活,ACP是最明顯的一個例子。此酶在中性或堿性環(huán)境中極不穩(wěn)定,血液在37℃放置1小時,ACP活性可下降50%。大部分酶在低溫中比較穩(wěn)定,分離血清如不能及時測定,應(yīng)放冰箱保存,表(7-3)是常用酶在不同溫度情況下的穩(wěn)定性。
從表7-3可看出-25℃將血清凍結(jié)并沒有太大優(yōu)點,相反有些酶如ALD、ALT在融凍時被破壞。有文獻(xiàn)報道用液氧在-195℃貯存血清,常用酶如ALT、AST、ALP、CK、LD、GGT和AMY,在10個月活性變化不大。個別酶如LD在低溫反而不如室溫穩(wěn)定,即所謂的“冷變性”。
表7-3 酶在不同溫度儲存的穩(wěn)定性(活性變化小于10%)
酶 | 室溫(25℃) | 冰箱(0-4℃) | 冰凍(-25℃) |
ALD | 2天 | 2天 | 不穩(wěn)定※ |
ALT | 2天 | 5天 | 不穩(wěn)定※ |
AST | 3天 | 1周 | 1月 |
ALP | 2-3天 | 2-3天 | 1月 |
GGT | 2天 | 1周 | 1月 |
CHE | 1周 | 1周 | 1周 |
LAP | 1周 | 1周 | 1周 |
CK | 1周 | 1周 | 1周 |
LD | 1周 | 1-3天 | 1-3天 |
ICD | 1天 | 2天 | 1天 |
AMY | 1月 | 7月 | 2月 |
LPS | 1周 | 3周 | 3周 |
ACP | 4小時¥ | 3天§ | 3天§ |
亞鐵氧化酶I | 1天 | 2周 | 2周 |
(銅氧化酶) |
※酶不耐融化;
¥ 標(biāo)本未酸化;
§標(biāo)本加枸櫞酸到pH5
血清酶的生理變異 | 免疫方法測酶質(zhì)量的臨床應(yīng)用 |
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