基礎(chǔ)檢驗學(xué)/血細胞分析儀應(yīng)用進展

跳轉(zhuǎn)到：導(dǎo)航, 搜索

臨床基礎(chǔ)檢驗學(xué)

血液學(xué)檢查
- 血液一般檢查
  - 儀器法血細胞檢查
    - 電阻抗法血細胞分析儀測試原理
    - 血細胞分析儀檢測參數(shù)的臨床意義
    - 方法學(xué)評價
    - 血細胞分析儀應(yīng)用進展

隨著高技術(shù)的引用和基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)的發(fā)展，各種類型的血液分析儀相繼問世。其進展主要表現(xiàn)在以下幾方面：

（一）儀器測試原理的改進

這些儀器主要體現(xiàn)在白細胞分類部分的改進，即電阻抗法的三分群發(fā)展為多項技術(shù)聯(lián)合同時檢測一個細胞，綜合分格實驗數(shù)據(jù)，得出的較為準(zhǔn)確的白細胞分群結(jié)果。迄今，世界上應(yīng)用的這類儀器主要有以下四種類型。

1．容量、電導(dǎo)、光散射（VCS）白細胞分類法VCS(volume conductivity lightscantter)技術(shù)可使血細胞在未經(jīng)任何處理，與體內(nèi)形態(tài)完全相同的自然狀態(tài)下得出檢測結(jié)果。首先在標(biāo)本內(nèi)中入只作用于紅細胞的溶血劑使紅細胞溶解，然后加入抗溶血劑，起中和前述溶血劑的作用，使白細胞表面、胞質(zhì)及細胞大小等特征仍然保持與體內(nèi)時間相同的狀態(tài)。

根據(jù)流體力學(xué)的原理使用鞘流技術(shù)使溶血后液體內(nèi)剩余的白細胞單個通過檢測器，VCS三種技術(shù)的同時檢測，體積的測量使用的是電阻抗原理。電導(dǎo)性是根據(jù)細胞壁能產(chǎn)生高頻電流的性能，采用高頻電磁探針測量細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu) — 細胞核、細胞質(zhì)的比例，細胞骨的化學(xué)成分，以此來幫助鑒別細胞。因此電導(dǎo)性可辨別體積完全相同的而性質(zhì)量同的兩個細胞群。如小淋巴細胞和嗜酸性粒細胞兩者直徑均為9-12μm，當(dāng)前高頻電流通過這兩種細胞時，由于他們的核與胞質(zhì)比例不同，而呈現(xiàn)出不同的信號，借此可把他們區(qū)分開來，光散射（scatter,S）是除了體積和電導(dǎo)性以外，又從細胞表面光散射的特點提供細胞類型的鑒別方式，來自激光光源的單色光束直接進入計數(shù)池的敏感區(qū)，在10⁰-70⁰時對每一個細胞進行掃描分析，提供細胞結(jié)構(gòu)、形態(tài)的光散射信息。光散射特別具有對細胞顆粒的構(gòu)型和顆粒質(zhì)量的區(qū)別能力。細胞粗顆粒挑散射要雙細顆粒更強，所以通過光散射可幫助儀器將粒細胞分開。

根據(jù)以上三種方法檢測的數(shù)據(jù)，經(jīng)計算機處理得出細胞分布圖（圖示-15）進而計算出實驗結(jié)果。圖中各圈內(nèi)的范圍均代表正常細胞和異常細胞在圖中可能出現(xiàn)的位置，數(shù)字代表細胞的類型。

VCS法細胞分布圖

圖2-15 VCS法細胞分布圖

1．幼稚細胞　2．桿狀核粒細胞

3．單核細胞　4．單核細胞或淋巴細胞

5．淋巴細胞　6．變異淋巴細胞

7．小型非典型淋巴細胞　8．有核紅細胞

9．巨大血小板　10．血小板凝塊

2．阻抗與射頻技術(shù)聯(lián)合的白細胞分類法這尖儀器白細胞計數(shù)通過四個不同檢測系統(tǒng)完成。

（1）嗜酸性粒細胞檢測系統(tǒng)：血液進入儀器后，經(jīng)分血器使血液與嗜酸性粒細胞特異計數(shù)的溶血的劑混合，由于其特殊的PH，使除嗜酸性粒細胞以外的所有細胞溶解或萎縮，含有完整的嗜酸性粒細胞液體的通過小孔時，使計數(shù)電路產(chǎn)生脈沖而被子計數(shù)。

（2）嗜三性粒細胞檢測系統(tǒng)：計數(shù)原理與嗜酸性粒細胞相同，由于堿性溶血劑只能保留與血液中嗜堿性的粒細胞，因此根據(jù)脈沖的多少即可求得嗜堿性粒細胞數(shù)。上述二種方法除需要使用專一的溶血劑外，還需特定的作用溫度和時間。

（3）淋巴、單核、粒細胞（中性、嗜堿性、嗜酸性性）的檢測系統(tǒng)：這個系統(tǒng)采用電阻與射頻聯(lián)合檢測的方式。使用的溶血劑的作用較輕溶血劑穿透細胞膜時僅使少量的胞質(zhì)溢出，對核的皺縮作用也較輕微，細胞形態(tài)改變不大。在小孔的內(nèi)外電級上存有直流和高頻兩個放射器，在小孔周圍存在直流電及射頻兩小及顆粒的多少。因此細胞進入小孔時產(chǎn)生兩個不同的脈沖信號，脈站的高低分別代表細胞的大小和核及顆粒的密度，以DC信號為橫叢標(biāo)，RF為縱坐標(biāo)，就可根據(jù)2個信號把同一個細胞定位于二維的細胞散射圖上。由于淋巴細胞、單核細胞及粒細胞的細胞大小、細胞質(zhì)含量，胞質(zhì)內(nèi)顆粒的大小與密度、細胞核的形態(tài)與密度不同，DC及EF的脈沖信號有較大的差異，定位在各自散射的區(qū)域，通過掃描技術(shù)得出各類細胞比例（見圖2-16）。

電阻抗與射頻聯(lián)合檢測白細胞分布圖

圖2-16 電阻抗與射頻聯(lián)合檢測白細胞分布圖

（4）幼稚細胞檢測系統(tǒng)：此胞膜上脂質(zhì)較成熟細胞少的現(xiàn)象，在細胞懸液加入硫化氨基酸后，由于細胞上脂質(zhì)占位不同，故結(jié)合在幼稚細胞的硫化氨基酸較成熟的細胞多，且對溶血劑有抵抗作用。當(dāng)加入溶血劑后，成熟細胞被溶解，如果懸液中存在細胞細胞，其形態(tài)不受契約壞，因此可通過電阻抗的方法檢測出來。（圖2-17）。

電阻抗與射頻聯(lián)合檢測白細胞、幼稚細胞、屏幕細胞分布圖

圖2-17電阻抗與射頻聯(lián)合檢測白細胞、幼稚細胞、屏幕細胞分布圖

3．光散射與細胞化學(xué)技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用于白細胞分類計數(shù)：聯(lián)合應(yīng)用激光射的過氧化物酶染色技術(shù)來進行白細胞分類計數(shù)。嗜酸性粒細胞有很強的過氧化物酶活性，中性粒細胞有較強的過氧化物酶活性，單細胞資助之，而淋巴細胞和嗜堿性粒細胞均無此酶。將血興高采烈經(jīng)過氧化物酶染色后，胞質(zhì)內(nèi)即可出現(xiàn)不同的酶化學(xué)反應(yīng)，由此構(gòu)成了此種血液分析儀的分析基礎(chǔ)，化妝品的分血器將血加入到含有清洗劑和甲醛的高滲液體內(nèi)（21倍稀釋）并孵育（40⁰～70⁰）20秒鐘。其中清洗劑（含有非離子表面活性劑）使細胞破壞，甲醛使白細胞質(zhì)內(nèi)酶被固定，此后發(fā)生第二步反應(yīng)，即加入過氧化氫和4氯=蔡酚，并加熱13秒，此時如果待測細胞質(zhì)中含有過氧化酶即可分解H₂O₂產(chǎn)生［O］，后者可使4氯-蔡酚顯色并沉積定位于酶反應(yīng)部位，此類細胞通過測試區(qū)時，由于酶反應(yīng)強度不同（陰性、弱陽性、強陽性）和細胞體大小不同，激光束射互細胞上的前向角和散射角有所不同，以X軸為吸光率標(biāo)記（酶反應(yīng)強度），Y軸為光散射（細胞大?。Ｃ總€細胞產(chǎn)生的兩個信號結(jié)合定位在細胞圖上（圖2-18）。每秒鐘儀器可測上千個細胞。計算機系統(tǒng)對存儲的資料進行分析處理，并結(jié)合嗜好堿性粒細胞或分葉核粒細胞通道結(jié)果計算出白細胞總參數(shù)和分類良數(shù)。

激光與細胞化學(xué)聯(lián)合檢測白細胞直方示意圖

圖2-18 激光與細胞化學(xué)聯(lián)合檢測白細胞直方示意圖

4．多角度偏振光散射白細胞分類技術(shù)（multi — Angle polatised scatter separation of white cell,MAPSS）其原理是一定體積的全血標(biāo)本用鞘流液按適當(dāng)比例稀釋。其白細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)近似于自然狀態(tài)，因嗜堿性粒細胞嘌粒具有吸濕的特性，所以嗜堿性粒細胞的結(jié)構(gòu)有輕微改變。紅細胞內(nèi)部的滲透透壓高于鞘興高采烈的滲透壓而發(fā)生改變，紅細胞內(nèi)的血紅蛋白從細胞內(nèi)游離出來，而鞘液內(nèi)的水分進入紅細胞中，細胞膜的結(jié)構(gòu)仍然完整，但此時的紅細胞折炮指數(shù)與鞘液的相同，故紅細胞不干擾白細胞檢測。

在水動力系統(tǒng)的作用下，樣本被集中為一個直徑為30μm的小股液流，該液流將稀釋細胞單個排列，因是單個通過激光束，故在各個方向都有其散射光?？梢詮乃膫€角度測定散射光的密度（見圖2-19）：①0⁰：前角光散射（1⁰～3⁰）粗略地測定細胞大??；②10⁰：狹角光散射（7⁰～11⁰）測細胞結(jié)構(gòu)及其復(fù)雜性的相對特征；③90⁰：90⁰消偏振光散射（70⁰`～110⁰），基于顆?？梢詫⒋怪苯嵌鹊钠窦す庀竦奶匦裕瑢⑹人峒毎麖闹行粤＜毎推渌毎蟹蛛x出來。④90⁰：垂直光散射（70⁰～110⁰）主要對細胞內(nèi)部顆粒和細胞成分進行測量?？梢詮倪@四個角度同時對個白細胞進行測量，同一種特定的程序自動儲存和分析數(shù)據(jù)，將白細胞分為嗜酸性粒細胞、中性粒細胞、嗜堿性粒細胞、淋巴細胞和單核細胞5種。

MAPSS測量原理

圖2-19 MAPSS測量原理

（二）儀器自動化水平的提高

80年代以前，血細胞分析儀主動脈要是半自動型。此類儀器需要將標(biāo)本經(jīng)機外預(yù)稀釋后才能檢測，惚受干擾，隨機誤差也很大。隨著全自動型儀器不斷涌現(xiàn)，血液直接被入血細胞分析儀后的在機內(nèi)自動稀釋、自動加溶血劑、定時檢測，提高了儀器的精確度和準(zhǔn)確度。

最近，“聯(lián)合型血液分析系統(tǒng)‘問世，這個系統(tǒng)將先進的血細胞分析儀、涂片機、染色下、網(wǎng)織紅細胞儀串聯(lián)在一起。血液先經(jīng)血細胞分析儀檢測，根據(jù)紅細胞情況決定是否做網(wǎng)織紅計數(shù)；根據(jù)HCT來改變推片機的角度和速度，以保證血涂片的合格。根據(jù)實驗數(shù)據(jù)和直方圖的變化，計算機選擇是否需要一步顯微鏡檢查。特別是自動加樣系統(tǒng)和真空采血管的應(yīng)用。不但可能避免實驗的隨機誤差，提高工作效率，而且可避免某些實驗環(huán)節(jié)造成的血行感染，對工作人員的勞動保護起以關(guān)鍵作用，成為儀器發(fā)展和使用的潮流。

（三）各種特殊技術(shù)的應(yīng)用

為了保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確，不同儀器使用不同的特殊技術(shù)：①為了使細胞計數(shù)準(zhǔn)確采用“三次計數(shù)“表決；②采用熱敏電阻裝置，監(jiān)測試劑溫度；③為了使積壓小板計數(shù)準(zhǔn)確，采用流技術(shù)及鞘流；④為同避免小細胞和大血小板干擾血小板計數(shù)，采用浮動界標(biāo)技術(shù)；⑤儀器自動保護技術(shù)、采用了燃燒電路、管道和過樣針的自動清洗及故障礙自檢功能；⑥各種方式的質(zhì)控制資料儲存和處理（比如X-B質(zhì)控法）。這些技術(shù)對于質(zhì)量控制起了關(guān)鍵作用。

以上介紹了近年來五分類法血細胞分儀白細胞分類的原理及臨床應(yīng)用價值。不難看出，由于高科技的應(yīng)用，使細胞分析更精確、更準(zhǔn)確，為臨床診斷與治療提供了重要依據(jù)，也大大提高了實驗室工作效率。但應(yīng)指出，各類儀器仍有其不足之處，如不能對單個細胞完全識別，特別是白血病細胞和正常單核細胞、異常不典型淋巴細胞，因為五分類法儀器的白細胞分類只是嚴(yán)格根據(jù)篩選標(biāo)準(zhǔn)報告實驗結(jié)果，必要時仍需以顯微鏡涂片檢查進行復(fù)檢。