醫(yī)學(xué)免疫學(xué)/抗原或抗體檢測(cè)的方法
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由于各種檢測(cè)方法中所用的抗原性狀不同，出現(xiàn)結(jié)果的現(xiàn)象也不同。最廣泛應(yīng)用方法有下述幾種：
（一）沉淀反應(yīng)
可溶性抗原與抗體結(jié)合，在兩者比例合適時(shí)，可形成較大的不溶性免疫復(fù)合物。在反應(yīng)體系中出現(xiàn)不透明的沉淀物，這種抗原抗體反應(yīng)稱為沉淀反應(yīng)（precipitation neaction）。
1．環(huán)狀沉淀試驗(yàn)先將含抗體的未稀釋的免疫血清加到直徑小于0.5cm的小試管底部。將稀釋的含有可溶性抗原的材料重疊于上，讓抗原與抗體在兩液體的界面相遇，形成白色免疫復(fù)合物沉淀環(huán)，故名為環(huán)狀沉淀試驗(yàn)（ring precipitationtest）,此法簡(jiǎn)便易行，需用材料較多是其缺點(diǎn)。
2．單向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)單向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)（single immunodiffusion）是在凝膠中進(jìn)行的沉淀反應(yīng)。將抗體混入加熱溶解的瓊脂中，傾注于玻片上，制成含有抗體的瓊脂板，在適當(dāng)位置打孔，將抗原材料加入瓊脂板的小孔內(nèi)，讓抗原從小孔向四周的瓊脂中擴(kuò)散，與瓊脂中的抗體相遇形成免疫復(fù)合物。當(dāng)復(fù)合物體積增加到一定程度時(shí)停止擴(kuò)散，出現(xiàn)以小孔為中心的圓形沉淀圈，沉淀圈的直徑與加入的抗原濃度成正相關(guān)。本方法簡(jiǎn)便，易于觀察結(jié)果，可測(cè)定抗原的靈敏度（最低濃度）約為10～20μg/ml，常用于定量測(cè)定人或動(dòng)物血清IgG、IgM、IgA和C3等，其缺點(diǎn)是需1～2天才能看結(jié)果（圖20-1）
圖20-1 單向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)示意圖
3．免疫比濁法 當(dāng)抗體濃度高，加入少量可溶性抗原，即可形成一些肉眼看不見(jiàn)的小免疫復(fù)合物，它可使通過(guò)液體的光束發(fā)生散射，隨著加入抗原增多，形成的免疫復(fù)合物也增多，光散射現(xiàn)象也相應(yīng)加強(qiáng)。免疫比濁法（immunonephelomytry）就是在一定的抗體濃度下，加入一定體積的樣品，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間，用光散射濁度計(jì)（nephelometry）測(cè)量反應(yīng)液體的濁度，來(lái)推算樣品中的抗原含量。本法敏感、快速簡(jiǎn)便，可取代單向擴(kuò)散法定量測(cè)定免疫球蛋白的濃度。
4，雙向免疫擴(kuò)散試驗(yàn) 雙免疫擴(kuò)散試驗(yàn)（double immunodiffusion）是在瓊脂板上按一定距離打數(shù)個(gè)小孔，在相鄰的兩孔內(nèi)分別放入抗原和抗體材料。當(dāng)抗原和抗體向四周凝膠中擴(kuò)散，在兩孔間可出現(xiàn)2～3條沉淀線，本法常用于抗原或抗體的定性或定量檢測(cè)，或用于兩種抗原材料的抗原相關(guān)性分析（圖20-2）。
圖20-2 雙向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)示意圖
5．對(duì)流免疫電泳 對(duì)流電泳（counterimmunoelectrophoresis）是一敏感快速的檢測(cè)方法，即在電場(chǎng)作用下的雙向免疫擴(kuò)散。將瓊脂板放入電泳槽內(nèi)，使瓊脂板的兩孔沿著電場(chǎng)的方向，于負(fù)極側(cè)的孔內(nèi)加入抗原，于正極側(cè)的孔內(nèi)加入抗體，通電后，抗原帶負(fù)電荷向正極泳動(dòng)，抗體分子雖也帶負(fù)電荷，但因分子量大，向正極的位移小，而受瓊脂中電滲作用向負(fù)極移動(dòng)，抗原和抗體能較快地集中在兩孔之間的瓊脂中形成免疫復(fù)合物的沉淀線。只需1小時(shí)左右即可觀察結(jié)果。
6．免疫電泳 免疫電泳(immunoelectrophoresis)的方法分成兩個(gè)步驟，即先進(jìn)行電泳，再進(jìn)行瓊脂擴(kuò)散。先將樣品加入瓊脂中電泳，將抗原各成分依電泳速度不同而分散開(kāi)。然后在適當(dāng)?shù)奈恢蒙涎仉娪痉较蛲谝恢本€形槽，于槽內(nèi)加入含有針對(duì)各種抗原混合抗體液，讓各抗原成分與相應(yīng)抗體進(jìn)行雙向免疫擴(kuò)散，可形成多答卷沉淀線。常用此法進(jìn)行血清的蛋白種類分析。對(duì)于免疫球蛋白缺損或增多的疾病的診斷或鑒別診斷有重要意義（圖20-3）。
圖20-3 免疫電泳法基本步示決圖
7．免疫印跡法免疫印跡法（immunoblotting）又稱為Western印跡法，用于AIDS的血清抗體檢測(cè)。第一步，為電泳分離HIV抗原，在電場(chǎng)中根據(jù)分子量大小不同病毒抗原各成分散開(kāi)。第二步，將電泳分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上（電印跡），然后將印跡有病毒抗原的硝酸纖維膜浸濕于病人血清中。如果病人血清中含有與一種或幾種抗原相對(duì)應(yīng)的抗體的話，則在該抗原印跡部位形成免疫復(fù)合物沉淀。在洗去未沉淀的抗原和抗體后，在膜上加標(biāo)記的抗人免疫球蛋白的抗體，此抗體可以和病毒抗原與人抗體形成的免疫復(fù)合物發(fā)生反應(yīng)，最后加入顯色底物（如果抗人Ig是用酶標(biāo)記的）或做放射自顯影（抗人Ig用125Ⅰ標(biāo)記）以顯示結(jié)果（圖20-4）。
圖20-4 用免疫印跡法檢查患者血清中的HIV病毒抗體
第一步：經(jīng)電泳將HIV混合抗合抗原按分子量大小分離；
第二步：將已分離的抗原經(jīng)電印跡轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上；
第三步：將待檢病人血清加入覆蓋于硝酸纖維膜上；
第四步：加入標(biāo)記的第二抗體使之覆蓋膜上；
第五步：加入顯色底物（或放射自顯影）顯現(xiàn)第二抗體
（二）凝集反應(yīng)
細(xì)菌、紅細(xì)胞或表面帶有抗原的乳膠顆粒等都是不溶性的顆?？乖?，當(dāng)與相應(yīng)抗體結(jié)合，抗原與抗體結(jié)合形成凝集團(tuán)塊，即稱為凝集反應(yīng)（agglutination）。
1．直接凝集 直接凝集（directagglutination）是將細(xì)菌或紅細(xì)胞與相應(yīng)抗體結(jié)合產(chǎn)生的細(xì)菌凝集或紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象?？捎糜?a href="/w/%E4%BC%A0%E6%9F%93%E7%97%85" title="傳染病">傳染病診斷如肥達(dá)氏反應(yīng)（Widal reaction）診斷傷寒病?；蚶?a href="/index.php?title=%E8%A1%80%E7%BB%86%E8%83%9E%E5%87%9D%E9%9B%86&action=edit&redlink=1" class="new" title="血細(xì)胞凝集（尚未撰寫）" rel="nofollow">血細(xì)胞凝集現(xiàn)象檢查血型。
2．間接凝集 間接凝集（indirectagglutination）是用可溶性抗原包被在乳膠顆?；蚣t細(xì)胞表面，與相應(yīng)抗體混合出現(xiàn)的凝集現(xiàn)象。如用γ球蛋白包乳膠顆粒檢測(cè)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎病人血清中的類風(fēng)濕因子，用甲狀腺球蛋白包被乳膠顆粒用于檢測(cè)甲狀腺球蛋的抗體。也可以將抗體吸附到乳膠顆粒上檢查臨床標(biāo)本中的抗原，如細(xì)菌或真菌性腦膜炎抗體包被的乳顆粒，一旦與含有相應(yīng)抗原的腦脊液混合，便可發(fā)生凝集，可進(jìn)行快速診斷。故凝集反應(yīng)即可測(cè)定抗原，也可測(cè)抗體，方法簡(jiǎn)便、敏感。
3．抗球蛋白試驗(yàn) 抗球蛋白試驗(yàn)（antiglobulintest,coombs test）的原理為間接凝集試驗(yàn)。例如應(yīng)用于診斷自身免疫溶血性貧血癥時(shí)，Rh+紅細(xì)胞與抗Rh血清間的反應(yīng)。因抗Rh抗體是IgG只有兩個(gè)結(jié)合價(jià)，分子較?。ú蝗鏘gM結(jié)合價(jià)多，分子大）很難直接引起Rh+紅細(xì)胞凝集。如果加入抗IgG的抗體，就可幫助抗Rh的IgG的抗體凝集紅細(xì)胞。也就是經(jīng)抗Ig的作用提高凝集反應(yīng)的靈敏度。
（三）補(bǔ)體參與抗原抗體反應(yīng)
這一類反應(yīng)主要包括溶血反應(yīng)（hemolytic assay）、補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞毒試驗(yàn)（complement mediated cytotoxicuty test）及補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)（complement fixation test）。
1．溶血反應(yīng) 抗體與紅細(xì)胞表面抗原相遇，形成紅細(xì)胞-抗體復(fù)合物即可使加入反應(yīng)中的補(bǔ)體活化，導(dǎo)致紅細(xì)胞溶解，此方法可用于紅細(xì)胞的各種抗原或相應(yīng)抗體的檢測(cè)，此法比凝集反應(yīng)敏感。溶血反應(yīng)也是用于抗體分泌細(xì)胞即空斑形成細(xì)胞（PFC）檢測(cè)的原理。
2．補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞毒試驗(yàn)各種有核細(xì)胞與針對(duì)其表面抗原的抗體相遇，所形成的免疫復(fù)合物能活化反應(yīng)中的補(bǔ)體，引起細(xì)胞膜穿孔，在一定時(shí)間內(nèi)，細(xì)胞仍能維持一定的形態(tài)不破碎，加入水溶性染如伊紅Y（eosin Y）或臺(tái)盼藍(lán)（trypanblue）后，染料即可進(jìn)入被活化補(bǔ)體穿孔的細(xì)胞，不帶相應(yīng)抗原細(xì)胞膜保持完整的活細(xì)胞不著色。此方法可用于帶各種抗原的細(xì)胞的檢測(cè)，如進(jìn)行細(xì)胞MHC抗原的鑒定，和進(jìn)行淋巴細(xì)胞中T細(xì)胞總數(shù)或其亞類的計(jì)數(shù)。在一些免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)中也可用這種方法，根據(jù)需要特異地消除帶某種抗原的細(xì)胞。
3．補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)當(dāng)抗原（可溶性或顆粒性）與相應(yīng)抗體結(jié)合，由于濃度低不出現(xiàn)可見(jiàn)反應(yīng)時(shí)，應(yīng)用補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)可檢出此抗原抗體反應(yīng)，它比凝集反應(yīng)或沉淀反應(yīng)靈敏度高。本法包括兩個(gè)抗原抗體系統(tǒng)。一為檢測(cè)系統(tǒng)由待檢樣品與已知抗原（或抗體）組成；另一為指示系統(tǒng)，由綿羊紅細(xì)胞（SRBC）和抗SRBC組成。另加入作為補(bǔ)體的新鮮豚鼠血清。試驗(yàn)時(shí)試管中先加入檢測(cè)系統(tǒng)和補(bǔ)體，混合經(jīng)37℃30分鐘使抗原、抗體、補(bǔ)體形成復(fù)合物，再加入指示系統(tǒng)，如出現(xiàn)溶血現(xiàn)象，說(shuō)明檢測(cè)系統(tǒng)中沒(méi)有相對(duì)應(yīng)的抗原抗體，補(bǔ)體是游離的指示系統(tǒng)的SRBC和抗體結(jié)合而出現(xiàn)溶血，即為反應(yīng)陰性。如不出現(xiàn)溶血，表明檢測(cè)系統(tǒng)中有抗原抗體復(fù)合物并結(jié)合補(bǔ)體，則指示系統(tǒng)無(wú)多余的補(bǔ)體作用而沒(méi)有溶血現(xiàn)象，即為陽(yáng)性。
在敏感的抗原、抗體檢測(cè)方法（如酶標(biāo)方法）出現(xiàn)之前補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)曾廣泛用于檢測(cè)各種細(xì)菌、病毒或螺旋體（如梅毒）的抗原或抗體，由于本試驗(yàn)影響因素多，結(jié)果不穩(wěn)定現(xiàn)已被新檢測(cè)方法所代替。
 抗原或抗體檢測(cè)的實(shí)用意義 | 用標(biāo)記抗體或抗原進(jìn)行的抗原、抗體反應(yīng)  |
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