多順反子
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在原核細(xì)胞中，通常是幾種不同的mRNA連在一起，相互之間由一段短的不編碼蛋白質(zhì)的間隔序列所隔開，這種mRNA叫做多順反子mRNA。這樣的一條mRNA鏈含有指導(dǎo)合成幾種蛋白質(zhì)的信息。
順反子的概念來自遺傳學(xué)中的順反重組試驗(yàn)，是確定交換片段究竟在一個(gè)基因內(nèi)還是屬于兩個(gè)基因的試驗(yàn)，簡言之，一個(gè)順反子就是一個(gè)基因，多順反子就是多個(gè)基因。真核生物中也有多順反子，比如C.elegans共有13500個(gè)基因，約25%的是多順反子(polycistronicmRNA)。
多順反子見于原核生物意指一個(gè)mRNA分子編碼多個(gè)多肽鏈。這些多肽鏈對(duì)應(yīng)的DNA片斷則位于同一轉(zhuǎn)錄單位內(nèi)，享用同一對(duì)起點(diǎn)和終點(diǎn)。
目錄 |
存在范圍和性質(zhì)
mRNA存在于原核和真核生物的細(xì)胞質(zhì)及真核細(xì)胞的某些細(xì)胞器（如和）中。RNA病毒和RNA噬菌體中的RNA既是遺傳信息的載體又具有mRNA的功能。生物體mRNA種類的多少與生物進(jìn)化水平有關(guān),高等生物所含的遺傳信息多，mRNA的種類也多。生物體內(nèi)某種mRNA的含量根據(jù)需要而有不同，如5齡蠶后部絲腺體的主要任務(wù)是快速合成大量絲心蛋白，因而編碼絲心蛋白的mRNA含量特別多。有些細(xì)菌需要不斷適應(yīng)外部環(huán)境，其體內(nèi)編碼某些誘導(dǎo)酶的mRNA的含量也較多。
原核和真核生物mRNA有不同的特點(diǎn)：①原核生物mRNA常以多順反子(見)的形式存在，即一條mRNA鏈編碼幾種功能相關(guān)聯(lián)的蛋白質(zhì)。真核生物mRNA一般以單順反子的形式存在，即一種mRNA只編碼一種蛋白質(zhì)。②原核生物mRNA的轉(zhuǎn)錄與翻譯一般是偶聯(lián)的，即轉(zhuǎn)錄尚未完畢,蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)譯合成就已開始。真核生物轉(zhuǎn)錄的mRNA前體則需經(jīng)后加工，加工為成熟的mRNA與蛋白質(zhì)結(jié)合生成信息體后才開始，工作信息體中蛋白質(zhì)與RNA之比約為3。③原核生物mRNA半壽期很短,一般為幾分鐘，最長只有數(shù)小時(shí)(RNA噬菌體中的RNA除外)。真核生物mRNA的半壽期較長，如胚胎中的mRNA可達(dá)數(shù)日。④原核與真核生物mRNA的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)也不同。
一級(jí)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系：原核生物mRNA一般5＇端有一段不翻譯區(qū)，稱前導(dǎo)順序，3＇端有一段不翻譯區(qū)，中間是蛋白質(zhì)的編碼區(qū)，一般編碼幾種蛋白質(zhì)。如大腸桿菌乳糖操縱子mRNA編碼3條多肽鏈;色氨酸操縱子mRNA編碼5條多肽鏈。也有單順反子形式的細(xì)菌mRNA，如大腸桿菌脂蛋白mRNA。原核生物mRNA分子中一般沒有修飾核苷酸，也沒有5＇端帽子結(jié)構(gòu)和3＇端聚腺苷酸尾巴。在原核生物mRNA的起始密碼子(AUG)附近（5＇方向上游）的一小段長短不等的順序，含有較多的嘌呤核苷酸，被稱為SD順序。它能和核糖體小亞基上的16SrRNA的3＇端富含嘧啶核苷酸的區(qū)域配對(duì)結(jié)合，有助于帶有甲酰甲硫氨酸的起始tRNA識(shí)別mRNA上的起始密碼(AUG)，使肽鏈合成從此開始。這段順序是1974年由J.夏因和L.達(dá)爾加諾發(fā)現(xiàn)的，所以稱為SD順序，也稱核糖體結(jié)合部位。原核生物mRNA的編碼區(qū)一般編碼幾種功能上相關(guān)聯(lián)的蛋白質(zhì)，兩種蛋白質(zhì)的編碼區(qū)之間常有一小段不翻譯的順序，叫做間隔區(qū)。有的噬菌體RNA中2個(gè)相鄰的順反子共用一段相同的編碼順序，例如，M噬菌體RNA中的溶菌蛋白編碼區(qū)共225個(gè)核苷酸中有189個(gè)核苷酸是由相鄰兩個(gè)蛋白質(zhì)共用的。原核mRNA與真核mRNA一樣使用同一套三聯(lián)體密碼子（真核生物線粒體mRNA有例外）。原核生物合成氨基酸的操縱子mRNA的5＇端前導(dǎo)順序上有一段順序稱作弱化子。弱化子具有兩種可以互變的構(gòu)象，其中一種構(gòu)象是轉(zhuǎn)錄終止的信號(hào)，能使轉(zhuǎn)錄中止（或衰減）。衰減調(diào)節(jié)是原核生物合成氨基酸的調(diào)控方式之一。
真核生物mRNA（細(xì)胞質(zhì)中的）一般由5＇端帽子結(jié)構(gòu)、5＇端不翻譯區(qū)、翻譯區(qū)（編碼區(qū)）、3＇端不翻譯區(qū)和3＇端聚腺苷酸尾巴構(gòu)成。分子中除G構(gòu)成帽子外，常含有其他修飾核苷酸，如A等。5＇端帽子結(jié)構(gòu)通常有3種類型，即：G（5＇）ppp(5＇)N；G(5＇)ppp(5＇)N和G(5＇)ppp（5＇）N。圖1b［真核生物mRNA結(jié)構(gòu)示意圖b5＇端帽子結(jié)構(gòu)式，表示堿基，表示堿基是帽子的化學(xué)結(jié)構(gòu)，N右邊的m代表核糖2＇位羥基的甲基化。真核細(xì)胞線粒體中的mRNA無帽子結(jié)構(gòu)。一般認(rèn)為帽子的功能與翻譯的啟動(dòng)有關(guān)。許多真核生物mRNA(如珠蛋白mRNA)除去帽子后翻譯效率大大降低。5＇端不翻譯區(qū)，也叫前導(dǎo)順序。不同的真核mRNA的前導(dǎo)順序長度不同，有的只有10個(gè)核苷酸,有的則有200個(gè)核苷酸。與原核mRNA相似，真核mRNA5＇端不翻譯區(qū)中常有一段順序與核糖體小亞基上的18SrRNA的3＇端的一段順序互補(bǔ)并結(jié)合，這種結(jié)合與真核mRNA的翻譯啟動(dòng)有關(guān)。
翻譯區(qū)(編碼區(qū))使用的密碼子除線粒體（如人、牛和酵母線粒體）外與原核生物mRNA是一樣的。真核生物mRNA的起始密碼子都是AUG。真核和原核生物mRNA使用的密碼子也都有“簡并現(xiàn)象”，即幾種不同的密碼子翻譯出同一種氨基酸，但不同的mRNA中簡并密碼子的利用率是不同的，真核與原核生物之間的差別就更大。mRNA的終止密碼子有3個(gè)（UAG、UGA和UAA），其功能是停止翻譯，一般只用一個(gè)終止密碼子就能使翻譯停止。有的mRNA有2個(gè)連續(xù)的終止密碼子（見）。3＇端不翻譯區(qū)的長短在不同的mRNA上有所不同，β珠蛋白mRNA只有39個(gè)核苷酸,而卵白蛋白mRNA則有637個(gè)核苷酸。真核生物mRNA3＇端不翻譯區(qū)常有AAUAA(A)或AUUUA(A)等順序，它們和識(shí)別多聚A聚合酶及裝配多聚A尾巴有關(guān)。除個(gè)別組蛋白mRNA外，真核生物mRNA3＇端均有多聚A尾巴3＇端多聚A尾巴的長度隨來源不同而不同,且隨mRNA的老化而變短,通常有20～200個(gè)A多聚A與mRNA穩(wěn)定性及mRNA從細(xì)胞核轉(zhuǎn)到細(xì)胞漿中有關(guān)?！ ?/p>
新型的表達(dá)系統(tǒng)
此處描述的是一個(gè)新型的表達(dá)系統(tǒng)，用以從一個(gè)單一多順反子構(gòu)建體中產(chǎn)生目的多基因產(chǎn)物。尤其是，該表達(dá)系統(tǒng)包含一個(gè)順反子載體，能夠在真核宿主細(xì)胞中表達(dá)功能抗體，其中載體在5′-3′方向上至少包含下面的可操作連接的元件：在真核細(xì)胞可操作的啟動(dòng)子；編碼至少抗體輕鏈可變區(qū)的DNA序列；內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)；以及至少一個(gè)編碼抗體重鏈的DNA序列。也公開了包含多順反子表達(dá)載體的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，和一種在用多順反子表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中產(chǎn)生功能抗體的方法。
新分節(jié)基因
來自德國科隆大學(xué)遺傳學(xué)系的Jo?lSavard、DiethardTautz等人發(fā)現(xiàn)擬谷盜（Tribolium，一種昆蟲）中的一個(gè)分節(jié)基因（Segmentationgene，負(fù)責(zé)昆蟲身體分節(jié)的基因）能夠產(chǎn)生一種克編碼多種保守肽的多順反子mRNA。
昆蟲的分節(jié)基因是早期胚胎產(chǎn)生體節(jié)必須的。在這篇論文中，德國的研究人員描述了擬谷盜的分節(jié)基因的gap家族的一個(gè)成員mlpt。Mlpt基因的敲除會(huì)導(dǎo)致昆蟲腹節(jié)變成胸節(jié)，從而使胚胎產(chǎn)生多達(dá)10對(duì)足。
研究人員證實(shí)在mlpt和已知的擬谷盜gap基因之間發(fā)生著交互調(diào)節(jié)反應(yīng)，在表明mlpt本身就是一個(gè)gap基因（裂缺基因）。Mlpt基因能反映出一種不同尋常的結(jié)構(gòu)，因?yàn)樗幋a一種多順反子mRNA，而這種mRNA又編碼四種肽。
由于在其他昆蟲基因組中也發(fā)現(xiàn)了具有多順反子排列的同源基因，因此研究人員推測(cè)Mlpt似乎是真核細(xì)胞中這種先前未知的基因結(jié)構(gòu)的原型?！ ?/p>
新基因簇轉(zhuǎn)錄
核仁小分子RNA(snoRNA)是一類在真核生物核糖體生物合成過程中起重要作用的小分子RNA。通過計(jì)算機(jī)分析國際分子生物學(xué)數(shù)據(jù)庫及實(shí)驗(yàn)的方法，在釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中發(fā)現(xiàn)和鑒定了一個(gè)的snoRNA(Z8)及其特殊的基因組織.Z8snoRNA基因位于釀酒酵母第13號(hào)染色體上，是酵母snoRNA基因簇的第1個(gè)基因，編碼boxC/D類反義snoRNA.結(jié)構(gòu)分析指出該snoRNA指導(dǎo)25SrRNA中第2421位尿苷酸的核糖的甲基化。用遺傳學(xué)方法將該基因缺失后，其對(duì)應(yīng)位點(diǎn)的甲基化被取消，但細(xì)胞的生長并未受到影響。Z8snoRNA基因的上游247位，有一UsnoRNA啟動(dòng)子保守元素。RTPCR的結(jié)果證明，Z8與該基因簇中其他snoRNA(Z7和Z6)基因共同轉(zhuǎn)錄成一個(gè)多順反子的snoRNA前體，然后再被加工成熟，這是一種新的snoRNA基因表達(dá)方式。
應(yīng)用前景
1、根據(jù)已發(fā)表的相關(guān)序列，分別設(shè)計(jì)引物，通過PCR技術(shù)克隆了一系列構(gòu)建水稻質(zhì)體多順反子定點(diǎn)整合表達(dá)載體所需的元件：質(zhì)體核糖體(16S)RNA操縱元啟動(dòng)子（Prrn）、質(zhì)體psbA基因3′端終止子（psbA3′）、氨基糖苷3′-腺苷酰基轉(zhuǎn)移酶基因（aadA）、水稻質(zhì)體基因組高頻同源重組片段(psbC/trnG，大小3362bp)，命名為crDNA、甘露聚糖酶基因（man）、綠熒光蛋白基因（gfp）。構(gòu)建了水稻質(zhì)體多順反子定點(diǎn)整合表達(dá)載體pLM21(-psbC-Prrn-RBS-man-RBS-gfp-RBS-aadA-psbA3′-trnG-)。將該載體用基因槍轟擊煙草葉片5槍，用添加了壯觀霉素的選擇分化培養(yǎng)基篩選。結(jié)果獲得質(zhì)體轉(zhuǎn)基因煙草4株。用PCR、激光掃描和Westernblot等方法檢測(cè)都證實(shí)man、gfp、aadA三個(gè)基因且均得到表達(dá)，用RFLP證實(shí)表達(dá)盒整合到煙草質(zhì)體基因組中。
2、利用腦心肌炎病毒(EMCV)及脊髓灰質(zhì)炎(Polio)病毒內(nèi)核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)，連接mIL-12p40及p35cDNAs和篩選基因新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(NeoR)，克隆至逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pGCEN中，使三個(gè)基因同時(shí)受逆轉(zhuǎn)錄病毒載體5′端LTR啟動(dòng)子控制，轉(zhuǎn)錄至同一mRNA轉(zhuǎn)錄本上，通過不同機(jī)制翻譯成蛋白質(zhì)，從而構(gòu)建成多順反子逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，即pGCEN/mIL-12。在LipofectAMINE介導(dǎo)下將pGCEN/mIL-12轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞PA317，G418篩選，直至出現(xiàn)陽性克隆，挑取抗性克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)，收集上清，用小鼠成纖維細(xì)胞NIH3T3測(cè)定病毒滴度。然后用重組轉(zhuǎn)錄病毒感染小鼠肝癌細(xì)胞MM45T.Li.G418篩選，直至出現(xiàn)抗性克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)，對(duì)陽性克隆進(jìn)行鑒定。結(jié)果是由PA317包裝細(xì)胞產(chǎn)生的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒的滴度為5×105CFU/ml，將其感染小鼠肝癌細(xì)胞MM45T.Li,后經(jīng)PCR及Southernblot證明，外源基因已整合至小鼠肝癌細(xì)胞基因組中，RT-PCR及Northernblot分析外源基因在mRNA水平上的表達(dá)，并證實(shí)mIL-12p40及p35cDNA和NeoR基因轉(zhuǎn)錄在同一mRNA上。ELISA顯示mIL-12的表達(dá)量48h為10ng/106細(xì)胞。并且M45/mIL-12培養(yǎng)上清能刺激人外周血單個(gè)核細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)小鼠脾細(xì)胞IFN-γ的產(chǎn)生(160U/ml)。
3、目前一種新的基因治療策略，即將不同耐藥譜基因?qū)胝?a href="/w/%E9%AA%A8%E9%AB%93" title="骨髓">骨髓造血干細(xì)胞之獲得耐藥表型，加大造血細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞克隆之間對(duì)化療耐受性的差別，增加骨髓對(duì)化療的耐受性，以便能施行大劑量化療、多次重復(fù)給藥使之最大限度清除腫瘤細(xì)胞，發(fā)揮化療效，為保護(hù)和及時(shí)恢復(fù)造血功能提供了可行性。
本研究項(xiàng)目中造血干細(xì)胞采用的是臍血干細(xì)胞［wangjishi,etal.LeukemiaReaearch.2002,26(3)281-288;實(shí)驗(yàn)生物學(xué)報(bào)2001,34(3)227-233］\外周血CD34+細(xì)胞［wangjishi,FangQinetaL.AxtaPharmacologicaSinica.2001,22(10):949-955］和小鼠骨髓細(xì)胞，轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞顯示對(duì)化療藥物的抗性增加。有效表達(dá)，增加了細(xì)胞對(duì)亞硝基類藥物（如BCNU）的耐愛性，證實(shí)該基因具有明顯的細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)。同進(jìn)通過體外誘導(dǎo)突變技術(shù)獲得了突變型MGMT，并成功構(gòu)建到逆轉(zhuǎn)錄病毒載體上。本研究為同內(nèi)首次以RT-PCR方法從人肝組織克隆了06-甲基鳥嘌呤-DNA-甲基轉(zhuǎn)移酶（MGMT）基因，與人類基因文庫MGMT基因同源性比為100%，將該基因?qū)氚屑?xì)胞后顯示有效表達(dá)，增加了細(xì)胞對(duì)亞硝基類藥物（如BCNU）的耐受性，證實(shí)該基因具有明顯的細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)。同進(jìn)通過體外誘導(dǎo)突變技術(shù)獲得了突變型MGMT，并成功構(gòu)建到逆轉(zhuǎn)錄病毒載體上。
本研究課題構(gòu)建了國內(nèi)外尚未報(bào)道的含ALDH1、ALDH3基因與IRES-MDRI基因的雙順反子逆病毒表達(dá)載體。同時(shí)證實(shí)了ALDH1、ALDH3均有抗活性環(huán)磷酰胺作用。在多順反子逆病毒表達(dá)載體GLNA-MGMT-NEOR-IRES-MDRI中，利用NEOR基因和MDRI的雙重作用建立了雙標(biāo)記系統(tǒng)。研究中涉及到了DNA序列分析，乒乓效應(yīng)，RT-PCR，PCR，NORTHERNBLOT，WESTERNBLOT，F(xiàn)ACS，MTT、建立高滴度產(chǎn)病毒細(xì)胞體系和安全高效的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)。
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