細胞免疫檢測法
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細胞免疫檢測法(assays of cellular immunity)，檢測參與免疫應(yīng)答的各種細胞（即免疫細胞）的數(shù)量和功能的方法。免疫細胞包括各類白細胞和它們的前體細胞。血液中的白細胞是成熟的免疫細胞的代表，可按形態(tài)分為淋巴細胞、單核細胞（在組織中轉(zhuǎn)變成巨噬細胞）、嗜中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞和漿細胞等?；校馨图毎挚山灞砻嫣卣骱凸δ艿牟煌俜譃?T細胞、B細胞、K細胞(殺傷細胞)和NK細胞（自然殺傷細胞）等。除血液外，大部分免疫細胞分布于身體各免疫器官中。各類免疫細胞都從骨髓造血干細胞分化而來，只有 T細胞在胸腺中成熟，其余細胞都在骨髓中成熟。免疫細胞成熟以后，被分送到血液、脾臟、淋巴結(jié)或其他淋巴組織行使功能。正常情況下，各免疫器官所含各類免疫細胞的數(shù)量和相互比例有一定的正常值范圍，其分布有一定的解剖學區(qū)域，如T細胞分布于脾臟和淋巴結(jié)的胸腺依存區(qū)、 B細胞分布于脾臟和淋巴結(jié)的非胸腺依存區(qū)。各類免疫細胞的正常含量與分布是維持免疫系統(tǒng)正常生理功能的基礎(chǔ)。各類免疫細胞能單獨或聯(lián)合地對各種外來的、內(nèi)生的不利于身體的大分子物質(zhì)或細胞產(chǎn)生適當?shù)姆磻?yīng)，將它們解毒、殺死、吞噬、消化，最后清除體外，以維持身體的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，便于正常生理活動的進行。由于免疫系統(tǒng)或其他系統(tǒng)的疾病，由于免疫接種或某些臨床治療措施，由于某些外界環(huán)境因素的影響，免疫細胞的數(shù)量和功能均可發(fā)生變化。這些變化又能引起身體其他生理功能的異常，或?qū)е赂鞣N新的繼發(fā)性病變。因此進行細胞免疫檢測，對于某些疾病的診斷和其發(fā)病機理的分析，對某些免疫接種或治療措施的效果評估，對某些環(huán)境因素對免疫細胞影響的研究等方面，都具有重要的意義。細胞免疫的檢測方法很多，內(nèi)容、目的及方法的難易程度有很大的不同，必須根據(jù)自己的目的和條件選用適當?shù)姆椒?。常用的細胞免疫檢測方法如下。
免疫細胞的數(shù)量檢測
正常情況下，身體各部分各類免疫細胞的含量與分布保持相對穩(wěn)定。任何疾病或異常原因打亂免疫細胞的新生與破損死亡兩過程的平衡，即可造成這些細胞數(shù)量與分布的變化。表1列出不同原因引起的免疫細胞數(shù)量變化的發(fā)生部位及細胞的特性。
各種原因引起的免疫細胞數(shù)量變化表現(xiàn)多數(shù)都在血液中有所反映。所以，血液是細胞免疫檢測法最常選用的樣品，只有在必要時，才從骨髓或其他免疫器官取材檢查。
①血液白細胞計數(shù)。是醫(yī)院最常用的化驗檢查項目之一，實際上就是血液中總的白細胞濃度的測定。成人血中白細胞濃度的正常值為4000～10000個/mm3。新生兒的正常值較成人高，為11000～20000個/mm3。血液白細胞計數(shù)是診斷的依據(jù)。若白細胞計數(shù)異常，則需要作白細胞分類等檢查（見血液常規(guī)檢查）。
②血液中白細胞的分類計數(shù)。正常人體血液中各類白細胞的數(shù)量有一定的比例。表2示其特征。
在異?；蚣膊∏闆r下，不管白細胞總數(shù)是否發(fā)生改變，各類白細胞之間相對數(shù)量的百分率都可能發(fā)生變化。這些變化是診斷的依據(jù)之一。血中白細胞分類計數(shù)方法比較簡單，屬于醫(yī)院的常規(guī)化驗檢查項目。取一滴血，在載玻片上做成涂片，經(jīng)固定染色，即可在顯微鏡下觀察。數(shù)100個細胞，計算每一類白細胞的百分率。
③血中T細胞與B細胞的分類計數(shù)。在正常人血中，T細胞與B細胞的數(shù)目分別占淋巴細胞總數(shù)的65～80％和5～15％。若兩類細胞的百分數(shù)發(fā)生變化，應(yīng)根據(jù)淋巴細胞總數(shù)來判斷這種變化是絕對數(shù)還是相對數(shù)變化引起的。在進行血中T細胞和B細胞分類計數(shù)時，大量紅細胞和粒細胞的存在給檢測帶來很大的不便，所以需要將淋巴細胞從血中分離出來，再根據(jù)T細胞和B細胞的表面標記不同，對提純的淋巴細胞作T細胞和B細胞的百分數(shù)測定。
不同血細胞的密度有差別，淋巴細胞較輕，比重低于1.077，紅細胞、粒細胞和血小板較重，比重高于1.077。若將加有抗凝劑的血放到比重為 1.077的細胞分離液表面上，將裝液體的試管離心，紅細胞、粒細胞和血小板均沉于細胞分離液之下到達管底，而淋巴細胞和少量單核細胞浮在細胞分離液之上。取出浮在上面的淋巴細胞，即可作T細胞與B細胞百分數(shù)的檢測。
人的T細胞表面有綿羊紅細胞(SRBC)的受體，因此可與綿羊紅細胞結(jié)合。若將分離提純的淋巴細胞與過量的SRBC混合，經(jīng)過離心使細胞緊密接觸。在室溫或4℃冰箱放置一段時間后，將細胞重新混懸起來，滴一滴細胞懸液在玻片上做成壓片，在顯微鏡下觀察。淋巴細胞可成為中心包繞三個以上SRBC，形成細胞集團，形如一個花環(huán)（圖1）。因紅細胞的英文字(erythrocyte)第一個字母是E，所以稱這種細胞集團為E-花環(huán)。E-花環(huán)中心的淋巴細胞就是 T細胞，不結(jié)成花環(huán)的散在淋巴細胞為非 T細胞。將結(jié)花環(huán)和不結(jié)花環(huán)的淋巴細胞分別計數(shù)，累計100或200個淋巴細胞即可得知淋巴細胞中含T細胞和非T細胞的百分數(shù)。
人的T細胞表面有CD3抗原，B細胞表面有表面免疫球蛋白。將分離提純的淋巴細胞用抗CD3的抗體作免疫熒光“染色”可使 T細胞帶上熒光物質(zhì)；用抗免疫球蛋白的抗體“染色”可以使 B細胞帶上熒光物質(zhì)。帶上熒光物質(zhì)的細胞在一定波長的激發(fā)光作用下可以產(chǎn)生熒光，用熒光顯微鏡或流式細胞計數(shù)器，可鑒別發(fā)熒光與不發(fā)熒光的細胞，并能分類計數(shù)。因此，對提純的淋巴細胞分別用CD3抗體或抗免疫球蛋白的抗體作免疫熒光染色，就可以進行淋巴細胞中含T細胞或B細胞百分數(shù)的檢測。這種方法比E-花環(huán)形成試驗的結(jié)果要準確一些。
人的 T細胞中帶CD4抗原的細胞稱T4細胞，帶CD8抗原的細胞稱T8細胞。T4與T8細胞組成T細胞的兩亞類，分別表現(xiàn)不同的免疫功能。在正常人，T4細胞數(shù)多于T8細胞數(shù)，兩者的比例約為2:1，在有些疾病中，其比例可發(fā)生變化。獲得性免疫缺陷綜合征時人免疫缺陷病毒侵犯T4細胞，引起T4細胞減少，可出現(xiàn)T4細胞與T8細胞比例倒置(小于1)的現(xiàn)象。對T4和T8細胞計數(shù)的方法，與對T細胞和B細胞的計數(shù)方法相似，可用抗CD4的抗體或抗CD8的抗體，分別對提純的淋巴細胞或T細胞進行免疫熒光染色，再用熒光顯微鏡或流式細胞計數(shù)器計數(shù)。
免疫細胞的功能檢測
在自然條件下，免疫細胞的功能都是在體內(nèi)完成的。但在進行免疫細胞功能檢查時，主要采用體外實驗的方法。其基本過程是，從待檢查者分離欲檢測的細胞，用適當?shù)拇碳の锘騿渭兊?a href="/w/%E8%90%A5%E5%85%BB%E6%B6%B2" title="營養(yǎng)液">營養(yǎng)液與細胞一起培養(yǎng)，觀測細胞發(fā)生的與體內(nèi)功能有關(guān)的反應(yīng)性變化。根據(jù)所用刺激物的性質(zhì)不同，可將試驗分為特異性反應(yīng)功能和非特異反應(yīng)功能檢測兩類。
①淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗。是淋巴細胞功能檢測最基本的方法。淋巴細胞平常在未受到刺激時，處于相對的代謝靜止狀態(tài)。在體外培養(yǎng)的淋巴細胞受到某些刺激物的作用后，經(jīng)過3～5天，可發(fā)生形態(tài)學的變化，胞漿增多，胞核擴大，繼而出現(xiàn)有絲分裂。這些變化稱為淋巴母細胞樣轉(zhuǎn)化現(xiàn)象或淋巴細胞增殖反應(yīng)。在淋巴細胞發(fā)生母細胞樣轉(zhuǎn)化的過程中，細胞的蛋白質(zhì)、RNA和DNA的合成都增加，出現(xiàn)代謝活化現(xiàn)象。因此，在進行淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗時，可用形態(tài)學的方法或生物化學的方法來檢測試驗結(jié)果。淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗可根據(jù)所用刺激物的不同分為三種。一為促有絲分裂素引起的淋巴細胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)。促有絲分裂素為一些來自植物或微生物的糖蛋白或多糖物質(zhì)，能非特異地作用于正常人的淋巴細胞，引起淋巴細胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)。適用于人的淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗的促有絲分裂素有五種，即植物血凝素(PHA)、刀豆蛋白A(ConA)、美洲商陸 (PWM)、金黃色葡萄球菌CowanⅠ株(SAC)、乙型副傷寒桿菌 (SPB)。它們引起T細胞和B細胞轉(zhuǎn)化的能力有不同。檢測之前，各實驗室需測定正常人 T細胞和B細胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)的均值與正常范圍，作為比較的標準。
特異性抗原引起的淋巴細胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)。在正常人體內(nèi)能與某一種特異抗原結(jié)合的淋巴細胞在全體淋巴細胞中只占很小的比例，約為幾十萬分之一。所以正常人的淋巴細胞幾乎不能對抗原發(fā)生可測的轉(zhuǎn)化反應(yīng)。人體接受某種抗原的刺激后，能與相應(yīng)抗原結(jié)合的淋巴細胞在體內(nèi)發(fā)生活化和增殖，轉(zhuǎn)變?yōu)閿?shù)量較多對抗原反應(yīng)明顯的致敏淋巴細胞。因此，受過抗原刺激的人，其淋巴細胞含有較多的致敏淋巴細胞，在體外與特導(dǎo)抗原一起培養(yǎng)便可發(fā)生淋巴細胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)?？乖鸬牧馨图毎D(zhuǎn)化試驗，在于檢測人體是否已經(jīng)接受過某種抗原的刺激。
混合淋巴細胞培養(yǎng) (MLC)反應(yīng)。是將組織相容性抗原（ HLA抗原）不同的兩個人的淋巴細胞放在一起培養(yǎng)時，發(fā)生的淋巴細胞轉(zhuǎn)化現(xiàn)象。在MLC反應(yīng)中，T細胞是反應(yīng)細胞，HLA抗原不同的異體B細胞是刺激細胞。如果二人的HLA抗原完全相同，則不會發(fā)生MLC反應(yīng)，或者稱為MLC反應(yīng)陰性。在某些疾病時，T細胞的免疫功能下降，病人對HLA抗原不同的人淋巴細胞發(fā)生MLC反應(yīng)的能力也減弱。
②淋巴因子產(chǎn)生試驗。淋巴細胞在受到各種刺激后發(fā)生代謝的活化，同時可產(chǎn)生并釋放多種有生物學活性的物質(zhì)，稱為淋巴因子。因此，淋巴因子產(chǎn)生試驗與淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗具有相似的意義，用來檢測淋巴細胞對不同刺激物的反應(yīng)能力。較常用的淋巴因子產(chǎn)生試驗是白細胞移動抑制因子（或巨噬細胞移動抑制因子）產(chǎn)生試驗。白細胞移動抑制因子和巨噬細胞移動抑制因子分別能抑制裝在毛細玻璃管中的白細胞或巨噬細胞向管口外移動。在作白細胞（或巨噬細胞）移動抑制因子產(chǎn)生試驗時，一般是用特異性抗原作刺激物，若淋巴細胞能發(fā)生反應(yīng)釋放白細胞移動抑制因子或巨噬細胞移動因子，說明此人已接受過該抗原的刺激，對該抗原可表現(xiàn)特異的細胞免疫反應(yīng)。此試驗的結(jié)果，往往與身體對同一抗原的遲發(fā)型過敏皮膚試驗的結(jié)果一致。
③細胞介導(dǎo)的細胞毒試驗。一種細胞通過直接接觸將另一種細胞殺傷的現(xiàn)象，稱為細胞介導(dǎo)的細胞毒作用。前種細胞為殺傷細胞，后種細胞為靶細胞。在人體內(nèi)有兩種能直接殺傷靶細胞的細胞，即自然殺傷細胞（NK細胞）和特異性殺傷 T細胞（特異性Tc細胞）。NK細胞可存在于未受抗原刺激的正常人體，對某些受感染的細胞、腫瘤細胞或正常的未成熟造血細胞有殺傷活性。特異性Tc細胞存在于受過特異抗原刺激的人體內(nèi)，能殺傷帶特異抗原的受感染細胞、異體細胞、自身組織細胞或腫瘤細胞。這兩種殺傷細胞借不同的機制在抗感染免疫、抗腫瘤免疫、自身免疫病及移植免疫的過程中均有重要意義。兩種殺傷細胞在體外的功能檢測，只是所用的靶細胞各不相同，檢測的方法都是相同的，常用放射性核素51銘（51Cr）釋放法。此方法的原理是，將靶細胞預(yù)先用51Cr標記，51Cr能與胞漿中的蛋白質(zhì)結(jié)合。靶細胞標記的51Cr量可用γ射線計數(shù)器測量其cpm值來表示。靶細胞與殺傷細胞混合后經(jīng)過離心，使兩種細胞壓緊，密切相互作用。培養(yǎng)一段時間后，被殺傷靶細胞內(nèi)的51Cr會釋放到胞外來，可以測量細胞培養(yǎng)液中游離51Cr的 cpm值，以表示靶細胞受破壞的程度(圖2)。因此，可用培養(yǎng)后所測培養(yǎng)液中的cpm值與靶細胞標記的總 51Cr量的 cpm值之比表示殺傷細胞對靶細胞的殺傷率(又稱 51Cr的特異釋放率)。靶細胞的51Cr特異釋放率即被殺傷百分率，與殺傷細胞的數(shù)量與殺傷速度成正相關(guān)，所以可用此測量結(jié)果作為殺傷細胞功能強弱的指標。
④抗體分泌細胞的檢測。分泌抗體的漿細胞由 B細胞分化而來，但在此分化過程中，往往需要T細胞與單核—巨噬細胞協(xié)作。因此對抗體分泌細胞的檢測，實際上是對B細胞、T細胞和巨噬細胞功能的綜合性評價?？贵w分泌細胞的檢測，依抗體的特異性不同，可分為針對某種抗原的特異抗體分泌細胞的檢測，以及無一定特異性的免疫球蛋白分泌細胞的檢測?？贵w分泌細胞的檢測還可因其產(chǎn)生的條件不同而分為三種方法，其結(jié)果表示的意義也有差別。在自然條件下人體內(nèi)存在的免疫球蛋白(Ig)分泌細胞，稱為自發(fā)性Ig分泌細胞。它們反映人體在自然情況下受抗原刺激的情況，并且與年齡的增長有關(guān)。受抗原注射后，在體內(nèi)產(chǎn)生的特異抗體的分泌細胞，能反映人體的體液免疫應(yīng)答功能。但是，對人無益的抗原不能輕易給人注射，此方法多用于動物試驗。取人的淋巴細胞，在體外培養(yǎng)，經(jīng)過各種刺激，能夠引起非特異性Ig分泌細胞的產(chǎn)生，稱為體外的抗體產(chǎn)生免疫應(yīng)答。此體外試驗對于分析T細胞、B細胞和巨噬細胞在抗體產(chǎn)生反應(yīng)中的功能作用很有意義?？贵w分泌細胞的具體檢測常用溶血空斑技術(shù)，即將待檢細胞與經(jīng)過處理的綿羊紅細胞混合，再加入補體及顯斑劑，灌入用兩張玻璃片做成的窄縫狀小室內(nèi)。經(jīng)過37℃培養(yǎng)一段時間，抗體分泌細胞周圍的綿羊紅細胞被溶解，形成一個圓形的透明區(qū)，稱為溶血空斑。空斑中心的抗體分泌細胞又稱為空斑形成細胞(PFC)。所以抗體分泌細胞的檢測也稱PFC的檢測。
⑤嗜中性粒細胞吞噬功能的檢測。血液白細胞中占比例最大的就是嗜中性粒細胞，能作較快的變形運動，有對異物的吞噬作用。對嗜中性粒細胞吞噬功能的檢測常用形態(tài)學檢查方法。將抗凝的血1～2ml經(jīng)過離心沉淀，取出壓積細胞表面的白細胞層(可混入一些紅細胞)，將此細胞與一定數(shù)量的細菌懸液混合，于37℃培養(yǎng)一段時間。用低速離心方法洗去白細胞外的細菌，將白細胞作涂片染色，于顯微鏡下觀察。順序觀察100～200個嗜中性粒細胞，并記下吞噬細菌的細胞數(shù)及被吞噬的細菌數(shù)。100 個嗜中性粒細胞中吞噬細菌的細胞數(shù)稱為吞噬百分率。在100個白細胞中，平均每個細胞吞噬的細菌數(shù)稱為吞噬指數(shù)。在對人或動物作嗜中性粒細胞吞噬功能檢測時，常需要同時計算出吞噬百分率和吞噬指數(shù)以綜合評價其吞噬功能。
⑥嗜中性粒細胞 NBT還原試驗。嗜中性粒細胞在吞噬細菌或異物后，還需要消化分解異物。這種能力與葡萄糖在細胞內(nèi)的氧化分解有關(guān)，在葡萄糖氧化脫氫的過程中，可以產(chǎn)生硝基藍四氮唑(NBT)還原的反應(yīng)。正常人的嗜中性粒細胞在吞噬異物后，可發(fā)生與消化異物相關(guān)的糖氧化分解反應(yīng)，若在體外遇到NBT，即可使NBT由黃色變成藍色的顆粒沉積于胞漿內(nèi)。慢性肉芽腫的患者，其吞噬細胞的吞噬作用表現(xiàn)正常，但對吞噬的異物缺乏消化分解的能力。用這些人的嗜中性粒細胞做 NBT還原試驗，呈現(xiàn)陰性反應(yīng)，即胞漿中不出現(xiàn)藍色顆粒，或只有很少的藍色顆粒。此外，在細菌感染時，NBT還原試驗呈陽性的吞噬細胞增加。
⑦巨噬細胞吞噬功能的測定。巨噬細胞是重要的免疫細胞，具有處理與傳遞抗原、產(chǎn)生白細胞介素1和其他細胞因子，以及吞噬異物或異常細胞的功能。巨噬細胞功能的檢查在動物進行的研究較多，在人的研究較少，因為從人體獲得巨噬細胞困難。中國張友會等人利用含有斑蝥浸出液的濾紙片貼于人的皮膚，引起皮皰，從皮皰液中可得到較多的巨噬細胞，這為進行人的巨噬細胞的研究提供了方便。巨噬細胞的體積大、吞噬力強，可用羊或雞的紅細胞作為吞噬作用的指標，檢測巨噬細胞的吞噬功能。這比用細菌作吞噬的指標較易觀察結(jié)果。
細胞免疫功能體內(nèi)測定技術(shù)
如延緩型皮膚變態(tài)反應(yīng)，又稱（遲發(fā)型超過敏反應(yīng)）包括結(jié)核菌素試驗、二硝基氯苯(DNCB)或二硝基氟苯(DNFB)皮膚試驗。結(jié)核菌素試驗是以不同類型的結(jié)核菌素和不同方法進行的皮膚試驗，用以診斷結(jié)核病及細胞免疫缺陷病的參考。試驗用舊結(jié)核菌素(OT)或純蛋白衍化物(PPD)，多用將試劑體內(nèi)注射的芒圖氏法。隔一段時間視局部有無紅暈、硬結(jié)，觀察人體對結(jié)核菌素有無延緩型變態(tài)反應(yīng)（Ⅳ型）。陽性者表示過去或現(xiàn)在接觸過結(jié)核桿菌，但不一定有活動性結(jié)核；陰性表示無結(jié)核感染，結(jié)核感染早期或病情危重、營養(yǎng)極度不良、某些急性傳染病（如麻疹）、惡性腫瘤時均可表現(xiàn)陰性。給小兒接種卡介苗前應(yīng)先做結(jié)核菌素試驗，陰性者方可接種。
二硝基氯苯和二硝基氟苯以致敏劑量涂于前臂，48～72小時后局部可見紅暈、硬結(jié)乃至大皰、潰瘍，表現(xiàn)似結(jié)核菌素試驗，這也是延緩型變態(tài)反應(yīng)。正常人多呈陽性，但細胞免疫缺陷者反應(yīng)減低或為陰性。此法用于測定腫瘤患者的細胞免疫功能。但因該試劑副作用大，現(xiàn)已很少用。
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