沙門氏菌
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沙門氏菌（Salmonella）沙門氏菌病的病原體。屬腸桿菌科，革蘭氏陰性腸道桿菌。已發(fā)現(xiàn)的近一千種(或菌株)。按其抗原成分，可分為甲、乙、丙、丁、戊等基本菌組。其中與人體疾病有關(guān)的主要有甲組的副傷寒甲桿菌，乙組的副傷寒乙桿菌和鼠傷寒桿菌，丙組的副傷寒丙桿菌和豬霍亂桿菌，丁組的傷寒桿菌和腸炎桿菌等。除傷寒桿菌、副傷寒甲桿菌和副傷寒乙桿菌引起人類的疾病外，大多數(shù)僅能目引起家畜、鼠類和禽類等動(dòng)物的疾病，但有時(shí)也可污染人類的食物而引起食物中毒。
目錄 |
沙門氏菌基本介紹
沙門氏菌病是公共衛(wèi)生學(xué)上具有重要意義的人畜共患病之一，其病原沙門氏菌屬腸道細(xì)菌科，包括那些引起食物中毒，導(dǎo)致胃腸炎、傷寒和副傷寒的細(xì)菌。它們除可感染人外，還可感染很多動(dòng)物包括哺乳類、鳥、爬行類、魚、兩棲類及昆蟲。人畜感染后可呈無(wú)癥狀帶菌狀態(tài)，也可表現(xiàn)為有臨床癥狀的致死疾，
它可能加重病態(tài)或死亡率，或者降低動(dòng)物的繁殖生產(chǎn)力。
蛋、家禽和肉類產(chǎn)品是沙門氏菌病的主要傳播媒介，感染主要取決于沙門氏菌的血清型和食用者的身體狀況，受威脅最大的是小孩、老年人及免疫缺陷個(gè)體。根據(jù)國(guó)際慣例，要求對(duì)易受沙門氏菌污染的食品進(jìn)行分類管理，以使大多數(shù)食物不含沙門氏菌，從而有效預(yù)防沙門氏菌病。為此，人們?cè)谔剿魃抽T氏菌檢測(cè)方法的過程中，作出了不懈的努力，現(xiàn)將有關(guān)進(jìn)展報(bào)告如下，并介紹兩種快速檢測(cè)沙門氏菌的試劑盒。
沙門氏菌抗原構(gòu)造與分類
o抗原
為脂多糖，性質(zhì)穩(wěn)定。能耐100℃達(dá)數(shù)小時(shí)，不被乙醇或0.1%石炭酸破壞。決定o型原特異性的是脂多糖中的多糖側(cè)鏈部分，以1、2、3等阿拉伯?dāng)?shù)字表示。例如乙型副傷寒桿菌有4、5、12三個(gè)。鼠傷寒桿菌有1、4、5、12四個(gè)；豬霍亂桿菌有6、7二個(gè)。其中有些o抗原是幾種菌所共有，如4、5為乙型副傷寒桿菌和鼠傷寒桿菌共有，將具有共同o抗原沙門氏菌歸為一組，這樣可將沙門桿氏菌屬分為a～z、o51～o63、o65～o67共有42組。我國(guó)已發(fā)現(xiàn)26個(gè)菌組、161個(gè)血清型。使人類致病的沙門氏桿菌大多屬于a～e組。o抗原刺激機(jī)體主要產(chǎn)生lgm抗體。
h抗原
為蛋白質(zhì)，對(duì)熱不穩(wěn)定，60℃經(jīng)15分鐘或乙醇處理被破壞。具有鞭毛的細(xì)菌經(jīng)甲醇液固定后，其o抗原全部被h抗原遮蓋，而不能與相應(yīng)抗o抗體反應(yīng)。h抗原的特異性取決于多肽鏈上氨基酸的排列順序和空間構(gòu)型。
沙門氏桿菌的h抗原有兩種，稱為第1相和第2相。第1相特異性高，又稱特異相，用a、b、c等表示，第2相特異性低，為數(shù)種沙門氏桿菌所共有，也稱非特異相，用1、2、3等表示。具有第1相和第2相h抗原的細(xì)菌稱為雙相菌，僅有一相者稱單相菌。每一組沙門氏桿菌根據(jù)h抗原不同，可進(jìn)一步分種或型。h抗原刺激機(jī)體主要產(chǎn)生lgg抗體。
vi抗原
因與毒力有關(guān)而命名為vi抗原。由聚-n-乙酰-d-半乳糖胺糖醛酸組成。不穩(wěn)定，經(jīng)60℃加熱、石碳酸處理或人工傳代培養(yǎng)易破壞或丟失。新從患者標(biāo)本中分離出的傷寒桿菌、丙型副傷寒桿菌等有此抗原。vi抗原存在于細(xì)菌表面，可阻止o抗原與其相應(yīng)抗體的反應(yīng)。vi抗原的抗原性弱。當(dāng)體內(nèi)菌存在時(shí)可產(chǎn)生一定量抗體；細(xì)菌被清除后，抗體也隨之消失。故測(cè)定vi抗體有助于對(duì)傷寒帶菌者的檢出。
沙門氏菌在感染細(xì)胞時(shí)采取嚴(yán)格的“三步走”戰(zhàn)略。首先，在自己的表面形成一個(gè)針狀突起，以此建立和目標(biāo)細(xì)胞之間的接觸，然后，一些專門的蛋白質(zhì)會(huì)通過這個(gè)突起抵達(dá)目標(biāo)細(xì)胞，破壞目標(biāo)細(xì)胞的細(xì)胞膜，打出一個(gè)“洞”，最后，沙門氏菌細(xì)胞通過這個(gè)“洞口”向目標(biāo)細(xì)胞釋放真正具有毒性的蛋白質(zhì)?！ ?/p>
傷寒沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌
兩種生物如果在生物分類上被歸入一個(gè)種，想必是非常親近的了。傷寒沙門氏菌Salmonella Typhi和鼠傷寒沙門氏菌Salmonella Typhimurium這兩個(gè)名字，看起來(lái)也夠像的。不過，它們的行為大不相同，基因序列也沒有那么像。
傷寒沙門氏菌只感染人類，損害肝、脾和骨髓，每年導(dǎo)致1600萬(wàn)人生病，60萬(wàn)人死掉，由于越來(lái)越多菌株具有抗藥性，情況可能變得更糟。鼠傷寒沙門氏菌對(duì)生活環(huán)境不那么挑剔，幾乎可感染一切地上走的或爬的活物，在人類身上造成的癥狀一般是食物中毒（愛吃生雞蛋的人小心），聽起來(lái)好像沒有傷寒那么可怕，但一些科學(xué)家認(rèn)為它的威脅更大，由此造成的食物中毒事件實(shí)際發(fā)生數(shù)目比報(bào)告數(shù)目可能多出30倍，每年有上億人感染，死亡人數(shù)比傷寒沙門氏菌多出一倍，主要是嬰幼兒和老人。
劍橋SANGER中心——還是這個(gè)中心，連項(xiàng)目的領(lǐng)導(dǎo)者也跟上面的鼠疫桿菌是同一人——從越南弄來(lái)了一種能夠抵抗多種抗生素的傷寒沙門氏菌菌株。測(cè)序發(fā)現(xiàn)，它的基因組里有200多個(gè)假基因， 它們一度起過作用，但在病菌適應(yīng)人體生活環(huán)境的過程中被拋棄了——而這也可能把它逼上了進(jìn)化的死角。科學(xué)家希望，這種單一的口味會(huì)使它比較容易對(duì)付，只要阻斷它感染人類的途徑，就有希望根除這種疾病。在此之前，根據(jù)基因組也可以設(shè)計(jì)出更好的疫苗和診斷方法。由于傷寒的癥與瘧疾和登革熱等病相似，很容易搞混?！ ?/p>
危害及影響
夏天正是新鮮蔬果搶閘上市的時(shí)節(jié)，而在大洋彼岸的美國(guó)，這個(gè)夏天卻有不少人因生吃西紅柿被“絆倒”了——據(jù)最近統(tǒng)計(jì)，目前，美國(guó)已有30個(gè)州幾百人因生食了從墨西哥進(jìn)口的帶有沙門氏菌的新鮮西紅柿而中毒，患者中至少48人因病情嚴(yán)重住院，其中1人死亡，而“生食療法”被視為一種健康的時(shí)尚，如今聽說生吃蔬果也會(huì)中毒，不少人十分著急：到底該如何預(yù)防？對(duì)此，專家指出，并不是所有的蔬果都越鮮吃越好，其實(shí)生吃蔬果有不少講究，有些菜涼拌前一定要用開水焯一下，徹底除塵去蟲更衛(wèi)生。
疫情：美國(guó)人生吃西紅柿“中毒”
生吃西紅柿等新鮮的時(shí)蔬水果是再平常不過的事了，然而，在美國(guó)中西部和南部30個(gè)州，近日卻有數(shù)百人因生食了從超市或是餐館購(gòu)買的新鮮西紅柿而出現(xiàn)發(fā)燒、腹瀉、腹痛等癥狀，這些西紅柿進(jìn)口自墨西哥。有幾十人因病情嚴(yán)重需住院，甚至已有重癥病人死亡。美國(guó)疾控中心通過檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，吃過這些西紅柿的患者檢查中都發(fā)現(xiàn)了沙門氏菌，看來(lái)，這是一起嚴(yán)重的沙門氏菌病疫情。
沙門氏菌是美國(guó)食物中毒致死的主要原因。美國(guó)人對(duì)這種病菌一點(diǎn)都不陌生，每年全國(guó)大約報(bào)告40000例沙門氏菌感染病例。但實(shí)際的感染人數(shù)可能要達(dá)20倍以上，因?yàn)樵S多輕型病人可能未確診，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，每年大約有1000人死于急性沙門氏菌感染。但是，以前各州爆發(fā)的疫情幾乎都與人們吃了染上沙門氏菌的肉類、蛋類、乳類有關(guān)，但迄今為止，很少聽說吃蔬果大面積受沙門氏菌污染甚至在人群中引發(fā)大疫情的。對(duì)此，周福生教授解釋說，這可能是西紅柿在生長(zhǎng)的過程中，由于空氣中紫外線不夠強(qiáng)烈，植物在灌溉過程或因土壤中含有沙門氏菌，這樣才使西紅柿的表皮上沾染了沙門氏菌，加上不少人有生食西紅柿的習(xí)慣，如果沒有清洗干凈，就完全有可能發(fā)生沙門氏菌感染。不光是食用西紅柿，其他瓜果蔬菜也一樣。
美國(guó)SIDNEY KIMMEL癌癥中心的科學(xué)家對(duì)鼠傷寒沙門氏菌進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)它的假基因比傷寒沙門氏菌少得多，只有40多個(gè)。此外，兩種病菌還各自擁有幾百個(gè)對(duì)方所不具備的基因。對(duì)于同屬一種的兩種生物來(lái)說，這種差異足夠讓人驚詫。已知的腸道沙門氏菌有2000種之多，有幾種已經(jīng)在測(cè)序中，屆時(shí)大家彼此對(duì)照起來(lái)看，就更有意思了?！ ?/p>
沙門氏菌檢測(cè)方法
自19世紀(jì)后期，沙門氏菌首次被鑒定為人類的一種病原以來(lái)，檢測(cè)方法學(xué)都是建立在采取感染病人的糞便或血液作為臨床病料的基礎(chǔ)上。此后的60年間，用于從食品中分離沙門氏菌的方法實(shí)質(zhì)上與那些用于臨床病料的方法是相同的。但至少有三個(gè)因素限制了用于臨床病料的方法應(yīng)用在食品分析上。第一，通常，沙門氏菌的含量水平在污染食品中比有感染病人的病料中要低很多；第二，食品本身的性質(zhì)會(huì)干擾病原的檢測(cè)，例如，某些食品中固有菌群可能處在一個(gè)很高的水平，從而影響特定細(xì)菌的選擇性分離和鑒定；第三，與臨床病料不同的是，經(jīng)過加工的食品，由于加熱、干燥、高含鹽量、酸和冷凍等因素的作用，其中的沙門氏菌受到了尚不致命的損傷或稱“致傷”。這就形成了一個(gè)具有不同生長(zhǎng)特性的細(xì)菌群。這種現(xiàn)象對(duì)那些希望從食物樣品中分離出沙門氏菌的食品分析家來(lái)說有很大影響，因?yàn)樵谶x擇培養(yǎng)基上直接培養(yǎng)“致傷”的沙門氏菌通常是以細(xì)菌死亡和試驗(yàn)失敗而告終。為克服這些困難，人們建立了一種簡(jiǎn)單的微生物增殖步驟，專門針對(duì)以食品為傳播載體的病原。雖然這些方法本身證明是可靠的，但卻很費(fèi)力、耗時(shí)，需要4～7天才能完成。因此，在需要及時(shí)、快速評(píng)價(jià)食品中微生物的安全性時(shí)，通常不被采用。隨著DNA和抗體技術(shù)的發(fā)展，近10～15年間發(fā)展了無(wú)數(shù)改進(jìn)的方法，其中許多可以在48h內(nèi)檢出沙門氏菌，這些方法通稱為快速檢測(cè)。
1、傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法
用于沙門氏菌分析的傳統(tǒng)方法是食物樣品分步增菌，以增加病原的可檢出率，這種培養(yǎng)方法總體可分4個(gè)不同階段或步驟。第一步(預(yù)增菌)，將樣品加到一種高營(yíng)養(yǎng)、無(wú)選擇性的培養(yǎng)基中，溫度37℃，使那些“致傷”的細(xì)菌復(fù)蘇及使所有微生物生長(zhǎng)。雖然緩沖胨水被建議常規(guī)使用(由于其可保持溶液pH值穩(wěn)定)，但對(duì)培養(yǎng)基的選擇仍存有爭(zhēng)論。第二，是選擇性增菌步驟，它使沙門氏菌生長(zhǎng)而使肉湯中同時(shí)存在的微生物數(shù)量減少，與預(yù)增菌培養(yǎng)基相似，對(duì)選擇性培養(yǎng)基的選擇，也存在許多不同的觀點(diǎn)。目前應(yīng)用的主要有如下3種類型：連四硫基鹽肉湯(Tetrathionatebroth)、硒酸鹽胱氨酸肉湯(Selenitecystinebroth)和RV(Rappaport-Vassiliadis)培養(yǎng)基。由于沒有任何一種培養(yǎng)基可以全面地保持所有食品基質(zhì)或各種沙門氏菌血清型，所以，較適當(dāng)?shù)淖龇ň褪鞘褂脙煞N培養(yǎng)基平行地進(jìn)行試驗(yàn)。第三步是分離步驟，即選擇性培養(yǎng)物在含一種或多種抑制非沙門氏菌生長(zhǎng)制劑的瓊脂平板上劃線培養(yǎng)，然后對(duì)平板上肉眼可見的特征性菌落進(jìn)行確認(rèn)，并對(duì)該菌落分離物進(jìn)行一系列生化和血清學(xué)檢測(cè)，以作出鑒定。傳統(tǒng)沙門氏菌檢測(cè)法全過程需時(shí)至少4～7天，才能得出明確的診斷結(jié)果。
2、以抗體為基礎(chǔ)的檢測(cè)方法
利用抗原-抗體反應(yīng)的顯著特異性，來(lái)進(jìn)行細(xì)菌的鑒別和血清學(xué)定型，已有半個(gè)多世紀(jì)的歷史。細(xì)菌菌體或鞭毛抗原的特異性抗體的存在，使得人們可以建立一些快速方法來(lái)檢測(cè)以食品為載體的病原。已經(jīng)建立的沙門氏菌免疫學(xué)檢測(cè)方法有許多種，大致可分為以酶標(biāo)抗體(ELISA)，熒光抗體染色(免疫熒光法)，同位素標(biāo)記抗體(放射免疫試驗(yàn))為基礎(chǔ)的方法及其它多種以抗體為基礎(chǔ)，利用乳膠凝集、免疫傳感器、免疫擴(kuò)散及免疫色譜技術(shù)的方法。但常規(guī)中最廣泛采用的是以雙位點(diǎn)ELISA技術(shù)即夾心ELISA為基礎(chǔ)的方法。此法改進(jìn)后用有放射活性的同位素替代標(biāo)記抗體，概括地說，是指以固定在固體基質(zhì)上的“捕捉”抗體來(lái)捕捉目標(biāo)抗原，經(jīng)洗滌除去未結(jié)合的成分，加入第二種酶標(biāo)抗體，此者結(jié)合在捕捉到的抗原的不同位點(diǎn)上，第二次洗滌后加入酶作用基質(zhì)，并令其與顏色成分反應(yīng)，然后用分光光度法即很容易檢測(cè)到目標(biāo)抗原。采用微量滴定板作為固態(tài)基質(zhì)使反應(yīng)形式標(biāo)準(zhǔn)化，并促成其自動(dòng)化。
黎兆滾等人首次在國(guó)內(nèi)口岸系統(tǒng)應(yīng)用微量板ELISA法(Salmonelletest1)對(duì)進(jìn)出口動(dòng)物產(chǎn)品(魚粉、肉骨粉等)進(jìn)行沙門氏菌檢測(cè)。該法采用預(yù)先包被了沙門氏菌(A-E群)單克隆抗體的微量板，加入經(jīng)增菌處理的樣品，反應(yīng)后再加入一定的指示劑，作用畢后用酶標(biāo)儀測(cè)定OD值來(lái)判定結(jié)果。食物樣品經(jīng)適當(dāng)?shù)脑鼍幚?，也可用此法進(jìn)行沙門氏菌檢測(cè)。ELISA法檢出沙門氏菌的極限范圍在105～106個(gè)細(xì)胞/ml，因此，要得出可靠的結(jié)果，食物樣品首先必需進(jìn)行預(yù)增菌、選擇性增菌，通常還要在含有D-甘露糖的肉湯(M肉湯)中進(jìn)行后增菌，以促進(jìn)鞭毛發(fā)育。總的來(lái)說，標(biāo)準(zhǔn)的ELISA法樣品的制備，約需要經(jīng)過40～48h的孵育才能完成。黎兆滾等人的微量板ELISA法(Salmonellatest1)樣品制備過程分步，共耗時(shí)24h：①選用營(yíng)養(yǎng)肉湯進(jìn)行預(yù)增菌(6h)，使“致傷”、冷凍的沙門氏菌復(fù)蘇。②使用選擇性培養(yǎng)基RV進(jìn)行增菌(14h)，使沙門氏菌大量繁殖，同時(shí)抑制其它雜菌生長(zhǎng)。③使用營(yíng)養(yǎng)肉湯(蛋白胨水)進(jìn)行后增菌(4h)，使沙門氏菌的數(shù)量大大增加。比上述標(biāo)準(zhǔn)的ELISA法樣品制備過程縮短了一半的時(shí)間。ELISA方法本身，則僅需要大約2h而已(其中30min是操作時(shí)間，90min是孵育時(shí)間)。相比之下，黎兆滾等人的方法可在27h內(nèi)完成，比上述方法縮短了一半的時(shí)間，頗值得推廣應(yīng)用。最新式的沙門氏菌免疫學(xué)檢測(cè)法，利用經(jīng)特異性抗體敏化的免疫色譜卡片為基礎(chǔ)。幾滴樣品加到卡片上，結(jié)果可以直接用肉眼讀出。免疫色譜卡片極易操作，且由于無(wú)需要特殊設(shè)備，很適合小型實(shí)驗(yàn)室使用。盡管卡片檢測(cè)法與ELISA法一樣需要對(duì)樣品進(jìn)行增菌處理，但它(卡片法)本身通常需時(shí)不超過10min，如果采用黎兆滾等人的樣品制備法，則可使操作時(shí)間更為縮短。
3、以核酸為基礎(chǔ)的方法
細(xì)胞核酸DNA和RNA是唯一一類可以攜帶信息的大分子。由于所有的細(xì)胞都含有這種分子，可以利用它作為檢測(cè)的標(biāo)靶。標(biāo)靶通常是一個(gè)特異性核酸序列，它可通過以補(bǔ)體核酸分子作為探針來(lái)檢出。與免疫學(xué)方法相似，探針也需要加附適當(dāng)?shù)臉?biāo)記，如放射性同位素、酶或發(fā)光的標(biāo)識(shí)物。Fitts等人在食品沙門氏菌檢測(cè)中引入了第一代DNA—RNA雜交技術(shù)，此法應(yīng)用的探針含有用放射性同位素標(biāo)記的傷寒沙門氏菌DNA片段，其敏感性高，經(jīng)大約48h的增菌步驟后，檢測(cè)極限可達(dá)108個(gè)細(xì)菌/ml，但由于要使用放射性同位素，只能在專門的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用，此方法的優(yōu)點(diǎn)都被抵消了。為此，以核酸雜交為基礎(chǔ)的第二代技術(shù)—比色計(jì)目前已發(fā)展起來(lái)。這種方法依賴于沙門氏菌核糖體RNA(rRNA)—核糖體發(fā)育過程中儲(chǔ)存的核酸成分的檢測(cè)。核糖體是細(xì)胞蛋白質(zhì)合成器的一部分，每個(gè)細(xì)菌細(xì)胞中存在5000～20000個(gè)復(fù)制體，而相比之下染色體DNA復(fù)制體僅2～10個(gè)。這種天然富含rRNA標(biāo)靶序列的情況使得用無(wú)輻射計(jì)檢測(cè)成為可能，同時(shí)又保持了與放射性同位素方法相當(dāng)或更高的敏感性。其另一優(yōu)點(diǎn)是由于rRNA為單鏈(而DNA為雙鏈)，雜交前無(wú)需經(jīng)過變性步驟。要得到陽(yáng)性結(jié)果，此法需要105個(gè)靶細(xì)胞/ml，因此對(duì)沙門氏菌檢測(cè)來(lái)說，需要進(jìn)行預(yù)增菌和選擇性增菌，總共約50h。rRNA探針法比沙門氏菌ELISA法(酶聯(lián)免疫檢測(cè)法)更耗時(shí)，但二者成本相近。食品細(xì)菌檢測(cè)法的最新進(jìn)展是在化學(xué)擴(kuò)增體系方面的發(fā)展，即聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，用該體系可對(duì)制備好的樣品進(jìn)行細(xì)菌DNA擴(kuò)增，以便更易于用諸如凝膠電泳法或比色型ELISA法檢測(cè)。用于檢測(cè)沙門氏菌和其它以食物為載體的病原的PCR方法業(yè)已建立，其中一些方法顯示了極好的敏感性。但該法較難自動(dòng)化，且必需經(jīng)選擇性增菌以稀釋可能干擾檢測(cè)反應(yīng)的某些成分。一個(gè)完整的以PCR為基礎(chǔ)的方法，需要2天才能完成，很大程度上抵銷了其高敏感性的優(yōu)點(diǎn)，但這種方法對(duì)那些含沙門氏菌較少或沙門氏菌“致傷”嚴(yán)重難以復(fù)蘇而仍保有沙門氏菌rRNA的樣品尤其有效。
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