黃曲霉毒素
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1993年黃曲霉毒素被世界衛(wèi)生組織(WHO)的癌癥研究機構(gòu)劃定為1類致癌物,是一種毒性極強的劇毒物質(zhì).黃曲霉毒素的危害性在于對人及動物肝臟組織有破壞作用,嚴重時,可導(dǎo)致肝癌甚至死亡.在天然污染的食品中以黃曲霉毒素B1最為多見,其毒性和致癌性也最強.
黃曲霉毒素（AFT）是一類化學(xué)結(jié)構(gòu)類似的化合物，均為二氫呋喃香豆素的衍生物。黃曲霉毒素是主要由黃曲霉 (aspergillus flavus) 寄生曲霉 (a.parasiticus) 產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，在濕熱地區(qū)食品和飼料中出現(xiàn)黃曲霉毒素的機率最高。B1是最危險的致癌物，經(jīng)常在玉米，花生，棉花種子，一些干果中常能檢測到。它們在紫外線照射下能產(chǎn)生熒光，根據(jù)熒光顏色不同，將其分為B族和G族兩大類及其衍生物。AFT目前已發(fā)現(xiàn)20余種。AFT主要污染糧油食品、動植物食品等；如花生、玉米，大米、小麥、豆類、堅果類、肉類、乳及乳制品、水產(chǎn)品等均有黃曲霉毒素污染。其中以花生和玉米污染最嚴重。家庭自制發(fā)酵食品也能檢出黃曲霉毒素，尤其是高溫高濕地區(qū)的糧油及制品種撿出率更高?！ ?/p>
目錄 |
發(fā)現(xiàn)
上世紀60年代,在英國發(fā)生的十萬只火雞突發(fā)性死亡事件被確認與從巴西進口的花生粕有關(guān).進一步的調(diào)研證明,這些花生粕被一種來自真菌的有毒物質(zhì)污染,這些研究工作最終使人們發(fā)現(xiàn)了黃曲霉(Aspergillus.flavus)產(chǎn)生的有毒代謝物質(zhì),黃曲霉毒素(Aflatoxins).是黃曲霉和寄生曲霉的代謝產(chǎn)物,特曲霉也能產(chǎn)生黃曲霉毒素,但產(chǎn)量較少.產(chǎn)生的黃曲霉毒素主要有B1,B2 ,G1 ,G2 以及另外兩種代謝產(chǎn)物M1 ,M2.其中M1 和M2是從牛奶中分離出來的.B1,B2 ,G1 ,G2 ,M1 和M2的在分子結(jié)構(gòu)上十分接近.
化學(xué)結(jié)構(gòu)
黃曲霉毒素(Aflatoxins)CAS號 1402-68-2,是一組化學(xué)結(jié)構(gòu)類似的化合物,目前已分離鑒定出12種,包括B1,B2,G1,G2,M1,M2,P1,Q,H1,GM,B2a和毒醇.黃曲霉毒素的的基本結(jié)構(gòu)為二呋喃環(huán)和香豆素,B1是二氫呋喃氧雜萘鄰?fù)难苌?即含有一個雙呋喃環(huán)和一個氧雜萘鄰?fù)?香豆素).前者為基本毒性結(jié)構(gòu),后者與致癌有關(guān).M1是黃曲霉毒素B1在體內(nèi)經(jīng)過羥化而衍生成的代謝產(chǎn)物.黃曲霉毒素的主要分子型式含 B1,B2,G1,G2 ,M1,M2等.其中M1和M2 主要存在于牛奶中.B1為毒性及致癌性最強的物質(zhì).
《黃曲霉毒素B1,B2,G1,G2,M1,M2化學(xué)結(jié)構(gòu)式》
黃曲霉毒素B1(CAS號1162-65-8)；
分子式：C17H12O6
分子量：312.27
黃曲霉毒素B2(CAS號7220-81-7)；
黃曲霉毒素G1(CAS號1165-39-5)；
黃曲霉毒素 G2(CAS號7241-98-7)；
黃曲霉毒素M1(CAS號6795-23-9)
黃曲霉毒素M2
理化特性
在紫外線下,黃曲霉毒素B1,B2發(fā)藍色熒光,黃曲霉毒素G1,G2發(fā)綠色熒光.黃曲霉毒素的相對分子量為312-346.難溶于水,易溶于油,甲醇,丙酮和氯仿等有機溶劑,但不溶于石油醚,己烷和乙醚中.一般在中性溶液中較穩(wěn)定,但在強酸性溶液中稍有分解,在pH9-10的強堿溶液中分解迅速.其純品為無色結(jié)晶,耐高溫,黃曲霉毒素B1的分解溫度為268℃紫外線對低濃度黃曲霉毒素有一定的破壞性.
【主要來源】
黃曲霉毒素是黃曲霉、寄生曲霉等產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物。當糧食未能及時曬干及儲藏不當時，往往容易被黃曲霉或寄生曲霉污染而產(chǎn)生此類毒素?！ ?/p>
分布
黃曲霉毒素存在于土壤,動植物,各種堅果,特別是花生和核桃中.在大豆,稻谷,玉米,通心粉,調(diào)味品,牛奶,奶制品,食用油等制品中也經(jīng)常發(fā)現(xiàn)黃曲霉毒素.一般在熱帶和亞熱帶地區(qū),食品中黃曲霉毒素的檢出率比較高,在我國,產(chǎn)生黃曲霉毒素的產(chǎn)毒菌種主要為黃曲霉,1980年測定了從17個省糧食中分離的黃曲霉1660株,廣西地區(qū)的產(chǎn)毒黃曲霉最多,檢出率為58%.總的分布情況為:華中,華南,華北產(chǎn)毒株多,產(chǎn)毒量也大,東北,西北地區(qū)較少.
分布與代謝
1. 分布與排泄：黃曲霉毒素進入機體后，在肝臟中的量較其他組織器官為高，說明肝臟可能受黃曲霉毒素的影響最大。腎臟、脾臟和腎上腺也可檢出，肌肉中一般不能檢出。黃曲霉毒素如不連續(xù)攝入，一般不在體內(nèi)積蓄。一次入后約1周即經(jīng)呼吸、尿、糞等將大部分排出。
2. 代謝：AFB1在動物體內(nèi)經(jīng)細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)微粒體混合功能氧化酶系代謝，在微粒體混合功能氧化酶系的作用下AFB1發(fā)生脫甲基、羥化及環(huán)氧化反應(yīng)主要代謝產(chǎn)物為AFM1、AFP1、AFQ1和AFB1-2，3-環(huán)氧化物?！ ?/p>
對人畜的危害
黃曲霉毒素對人和動物健康的危害均與黃曲霉毒素抑制蛋白質(zhì)的合成有關(guān).黃曲霉毒素分子中的雙呋喃環(huán)結(jié)構(gòu),是產(chǎn)生毒性的重要結(jié)構(gòu).研究表明,黃曲霉毒素的細胞毒作用,是干擾信息RNA和DNA的合成,進而干擾細胞蛋白質(zhì)的合成,導(dǎo)致動物全身性損害(Nibbelink,1988).黃光琪等(1993)研究指出,黃曲霉毒素B1能與tRNA結(jié)合形成加成物,黃曲霉毒素-tRNA加成物能抑制tRNA與某些氨基酸結(jié)合的活性,對蛋白質(zhì)生物合成中的必需氨基酸,如賴氨酸,亮氨酸,精氨酸和甘氨酸與tRNA的結(jié)合,均有不同的抑制作用,從而在翻譯水平上干擾了蛋白質(zhì)生物合成,影響細胞代謝..
1,黃曲霉毒素與動物疾病
黃曲霉毒素中毒(Aflatoxicosis)主要對動物肝臟的傷害,受傷害的個體因動物種類,年齡,性別和營養(yǎng)狀態(tài)而異.研究結(jié)果表明,黃曲霉毒素可導(dǎo)致肝功能下降,降低牛奶產(chǎn)量和產(chǎn)蛋率.并使動物的免疫力降低,易受有害微生物的感染.此外,長期食用含低濃度黃曲霉毒素的飼料也可導(dǎo)致胚胎內(nèi)中毒.通常年幼的動物對黃曲霉毒素更敏感.黃曲霉毒素的臨床表現(xiàn)為消化系統(tǒng)功能紊亂,降低生育能力.降低飼料利用率,貧血等.黃曲霉毒素不僅能夠使奶牛的產(chǎn)奶量下降,而且還使牛奶中含有轉(zhuǎn)型的黃曲霉毒素M1和M2.據(jù)美國農(nóng)業(yè)經(jīng)濟學(xué)家統(tǒng)計,由于食用黃曲霉毒素污染的飼料,每年至少要使美國畜牧業(yè)遭受10%的經(jīng)濟損失.在我國,由此而帶來的畜牧業(yè)損失可能會更大.
2,黃曲霉毒素與人類的健康
人類健康受黃曲霉毒素的危害主要是由于人們食用被黃曲霉毒素污染的食物.對于這一污染的預(yù)防是非常困難的,其原因是由于真菌在食物或食品原料中的存在是很普遍的.國家衛(wèi)生部門禁止企業(yè)使用被嚴重污染的糧食進行食品加工生產(chǎn),并制定相關(guān)的標準監(jiān)督企業(yè)執(zhí)行.但對于含黃曲霉毒素濃度較低的糧食和食品無法進行控制.在發(fā)展中國家,食用被黃曲霉毒素污染的食物與癌癥的發(fā)病率呈正相關(guān)性.亞洲和非洲的疾病研究機構(gòu)的研究工作表明,食物中黃曲霉毒素與肝細胞癌變 (Liver Cell Cancer,LCC) 呈正相關(guān)性.長時間食用含低濃度黃曲霉毒素的食物被認為是導(dǎo)致肝癌,胃癌,腸癌等疾病的主要原因.1988年國際腫瘤研究機構(gòu)(International Agency for Research on Cancer,IARC) 將黃曲霉毒素B1列為人類致癌物.除此以外,黃曲霉毒素與其它致病因素(如肝炎病毒)等對人類疾病的誘發(fā)具有疊加效應(yīng).
黃曲霉毒素Bl的半數(shù)致死量為0.36毫克/公斤體重,屬特劇毒的毒物范圍(動物半數(shù)致死量<10毫克/公斤=它的毒性比氰化鉀大10倍,比砒霜大68倍).它引起人的中毒主要是損害肝臟,發(fā)生肝炎,肝硬化, 肝壞死等.臨床表現(xiàn)有胃部不適,食欲減退,惡心,嘔吐,腹脹及肝區(qū)觸痛等;嚴重者出現(xiàn)水腫,昏迷,以至抽搐而死.黃曲霉毒素是目前發(fā)現(xiàn)的最強的致癌物質(zhì).其致癌力是奶油黃的900倍,比二甲基亞硝胺誘發(fā)肝癌的能力大75倍,比3,4苯并芘大4000倍.它主要誘使動物發(fā)生肝癌,也能誘發(fā)胃癌,腎癌,直腸癌及乳腺,卵巢,小腸等部位的癌癥.
檢驗檢疫
(一)部分國家檢驗檢疫要求:
● 1995年,世界衛(wèi)生組織制定的食品黃曲霉毒素最高允許濃度為15ug/kg.
● 我國政府對各種食物中黃曲霉毒素的最高允許量見表2.
表2 中國對食品中黃曲霉毒素的最高允許含量
食 物 名 稱
最高允許含量/(ug/kg)
玉米,花生仁制品(按原料折算)
大米,其他食用油(香油,菜籽油,大豆油,葵花油,胡麻油,茶油,麻油,玉米胚芽油,米糠油,棉籽油)
其他糧食(麥類,面粉,薯干),發(fā)酵食品(醬油,食用醋,豆豉,腐乳制品),淀粉類制品(糕點,餅干,面包,裱花蛋糕)
牛乳及其制品(消毒牛奶,新鮮生牛乳,全脂牛奶粉,淡煉乳,甜煉乳,奶油),黃油,新鮮豬組織(肝,腎,血,瘦肉)
20(黃曲霉毒素B1)
20(黃曲霉毒素B1)
10(黃曲霉毒素B1)
5黃曲霉毒素B1)
0.5(黃曲霉毒素M1)
● 美國聯(lián)邦政府有關(guān)法律規(guī)定人類消費食品和奶牛飼料中的黃曲霉毒含量(指B1+B2+G1+G2的總量)不能超過15ug/kg.人類消費的牛奶中的含量不能超過0.5ug/kg,其他動物飼料中的含量不能300ug/kg.
● 而歐盟國家規(guī)定更加嚴格,落花生和堅果及其加工產(chǎn)品和所有谷類食品及加工產(chǎn)品中黃曲霉毒素B1限量為2.0μg/kg；原奶、熱處理奶及加工奶產(chǎn)品中M1限量為0.050μg/kg；嬰兒食品（包括嬰幼兒奶）中M1限量為0.025μg/kg?！?/p>
(二)檢驗檢疫方法:
1,薄層層析法
薄層層析(Thin-Layer Chromatography,TLC)是在黃曲霉毒素研究方面應(yīng)用最廣的分離技術(shù).自1990年,它被列為AOAC (Association of Official Agricultural Chemists)標準方法,該方法同時具有定性和定量分析黃曲霉毒素的功能.
2,液相色譜法
液相色譜(Liquid Chromatography,LC)與薄層層析在許多方面具有相似性,二者互相補充.通常用TLC進行前期的條件設(shè)定,選擇適宜的分離條件后,再用LC進行黃曲霉毒素的定量測定.
3,免疫化學(xué)分析方法
利用具有高度專一性的單克隆抗體或多克隆抗體設(shè)計的黃曲霉毒素的免疫分析方法,也是最常用的黃曲霉毒素檢測方法.這類方法通常包括放射免疫分析方法(Radioimmunoassay,RIA),酶聯(lián)免疫法(Enzyme-linked of Immunosorbent Assay,ELISA)和免疫層析法(Immunoaflinity Column Assay,ICA).它們均可以對黃曲霉毒素進行定量測定.
(1) 免疫親和柱-熒光分光光度法和免疫親和術(shù)-HPLC法
免疫親和柱法和酶聯(lián)免疫吸附法雖然都可達到速簡便效果,但酶聯(lián)免疫吸附法僅能檢測單一毒素(如黃曲霉毒素B1)含量,而且易出現(xiàn)假陽性結(jié)果,難以控制.免疫親和柱法(包括熒光光度法和HPLC法)卻能達到既定量準確又快速簡便的要求.
免疫親和柱的使用可以避免傳統(tǒng)TLC和HPLC的缺點,同時免疫親和柱與TLC和HPLC法結(jié)合可以大大提高工作效率,提高靈敏度和準確度.
黃曲霉毒素免疫親和柱-熒光光度計法是以單克隆免疫親和柱為分離手段,用熒光計,紫外燈作為檢測工具的快速分析方法.它克服了TLC和HPLC法在操作過程中使用劇毒的真菌毒素作為標定標準物和在樣品預(yù)處理過程中使用多種有毒,異味的有機溶劑,毒害操作人員和污染環(huán)境的缺點.同時黃曲霉毒素免疫親和柱-熒光光度計法分析速度快,一個樣品只需10-15min,比傳統(tǒng)方法快幾個小時甚至幾天時間;儀器設(shè)備輕便容易攜帶,自動化程度高 ,操作簡單,直接讀出測試結(jié)果,可以在小型實驗或現(xiàn)場使用.可以進行黃曲霉毒素總量 (B1B2G1G2) 的測定,檢測限可達到1ug/kg,達到黃曲霉毒素標準限量值以下測定范圍為1-300ug/kg.
黃曲霉毒素免疫親和柱-高效液相色譜法比傳統(tǒng)的HPLC法更加安全,可靠,靈敏度和準確度高.它采用單克隆抗體免疫技術(shù),可以特效性地將黃曲霉毒素或其他真菌毒素分離出來,分離效率和回收率高.
分析原理試樣中的黃曲霉毒素用一定比例的甲醇/水提取液經(jīng)過過濾,稀釋后,用免疫親和柱凈化,以甲醇將親和柱上的黃曲霉毒素淋洗下來,在淋洗液中加入溴溶液衍生,以提高測定靈敏度,然后用熒光分光光度計進行定量.也可以將甲醇-黃曲霉毒素淋洗液的一部分注入HPLC中,對黃曲霉毒素B1,B2,G1,B2分別進行定量分析.免疫親和柱是用大劑量的黃曲霉毒素單克隆抗體固化在水不溶性的載體上,然后裝柱而成.該方法的測定范圍0-300ug/kg.
(2) 酶聯(lián)免疫吸附法:
1996年,Nakane 建立了辣根過氧化物酶標記抗體的測定技術(shù).由于該方法簡便,敏感,特異,可作為多種抗原或抗體的測定,20世紀70年代后期,該方法引入真菌毒素的檢測中,下面介紹的是競爭性酶聯(lián)免疫吸附間接法檢測黃曲霉毒素B1.
原理:將已知抗原吸附在固態(tài)載體表面,洗除末吸附抗原,加入一定量抗體與待測樣品(含有抗原)提取液的混合液,競爭培養(yǎng)后,在固相載體表面形成抗原抗體復(fù)合物.洗除多余抗體成分,然后加入酶標記的抗球蛋白的第二抗體結(jié)合物,與吸附在固體表面的抗原抗體結(jié)合物相結(jié)合,再加入酶底物.在酶的催化作用下,底物發(fā)生降解反應(yīng),產(chǎn)生有色物質(zhì),通過酶標檢測儀測出酶底物的降解量,從而推知被測樣品中的抗原量.
(3) 微柱篩選法 可以用來半定量測定各種食品中黃曲霉毒素B1,B2,G1,G2的總量.
原理 樣品提取液中的黃曲霉毒素被微柱管風(fēng)硅鎂型吸附層吸附后,在波長365nm紫外光燈下顯示藍紫色熒光環(huán),其熒光強度與黃曲霉毒素在一定的光密度范圍內(nèi)成正比例關(guān)系.若硅鎂型吸附劑層未出現(xiàn)藍紫色熒光,則樣品為陰性(方法靈敏度為5-10ug/kg).由于在微柱上不能分離黃曲霉毒素B1,B2,G1,G2,所以測得結(jié)果為總的黃曲霉毒素含量.
(4) 一步式黃曲霉毒素檢測金標試紙法
一步式黃曲霉毒素檢測金標試紙法是利用單克隆抗體而設(shè)計的固相免疫分析法.由此產(chǎn)生的一步式黃曲霉毒素快速檢測試紙可在5-10分鐘完成對樣品中黃曲霉毒素的定性測定.借助黃曲霉毒素標準樣品,這種方法能估算黃曲霉毒素的含量,非常適用于現(xiàn)場測試和進行大量樣品的初選.
檢測方法分析
薄膜層析法和液相色譜法是目前國內(nèi)絕大多數(shù)檢測機構(gòu)都在使用的方法,由于其檢測周期長,程序復(fù)雜,所需試劑繁多等缺點已遠遠不能滿足現(xiàn)代檢測要求.隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展,特別是免疫學(xué),生物化學(xué),分子生物學(xué)的不斷發(fā)展,人們已創(chuàng)建了不少快速,簡便,特異,敏感,低耗且適用的黃曲霉毒素檢測方法.而且以金標試紙為代表的這些方法已經(jīng)被先進國家所廣泛使用,引進和消化這些先進的方法是我們檢測領(lǐng)域的當務(wù)之急.免疫親和柱法優(yōu)點很多,但由于檢測費用過高,而無法普及.而一步式黃曲霉毒素檢測金標試紙法似乎更適用于我國,值得推廣.
特性
1、AFT的毒性極強
遠遠高于氰化物、砷化物和有機農(nóng)藥的毒性，其中以B1毒性最大。當人攝入量大時，可發(fā)生急性中毒，出現(xiàn)急性肝炎、出血性壞死、肝細胞脂肪變性和膽管增生。當微量持續(xù)攝人，可造成慢性中毒，生長障礙，引起纖維性病變，致使纖維組織增生。AFT的致癌力也居首位，是目前已知最強致癌物之一。
2、AFT具耐熱性
一般烹調(diào)加工溫度不能將其破壞，裂解溫度為280℃。在水中溶解度較低，溶于油及一些有機溶劑，如氯仿和甲醇中，但不溶于乙醚、石油醚及乙烷。
3、食品中所污染的主要是黃曲霉毒素Bl，其毒性目前一般認為有三種臨床特征；急性中毒、慢性中毒和致癌性：
(1)急性中毒：
它是一種劇毒物質(zhì)，毒性比KCN大10倍，比砒霜大68倍，僅次肉毒霉素，是目前已知霉菌中毒性最強的。它的毒害作用，無論對任何動物，主要變化是肝臟，呈急性肝炎、出血性壞死、肝細胞脂肪變性和膽管增生。脾臟和胰臟也有輕度的病變。
(2)慢性中毒：
長期攝入小劑量的黃曲霉毒素則造成慢性中毒。其主要變化特征為肝臟出現(xiàn)慢性損傷，如肝實質(zhì)細胞變性、肝硬化等。出現(xiàn)動物生長發(fā)育遲緩，體重減輕，母畜不孕或產(chǎn)仔少等系列癥狀
(3)致癌性：
AFT是目前所知致癌性最強的化學(xué)物質(zhì)
其致癌特點是：
A 致癌范圍廣，能誘發(fā)魚類、禽類，各種實驗動物、家畜及靈長類等多種動物的實驗?zāi)[瘤；
B 致癌強度大，其致癌能力比六六六大1萬倍；
C 可誘發(fā)多種癌，AFT主要誘發(fā)肝癌，還可話互胃癌、腎癌、淚腺癌、直腸癌、乳腺癌，卵巢及小腸等部位的腫瘤，還可出現(xiàn)畸胎。
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